棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

摘要：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶。本研究采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在转基因玉米中的表达

本研究拟构建携带猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白基因(TGEV-S)的转基因玉米植株并检测其表达情况。首先利用PCR方法自携带TGEV-S基因的重组质粒中扩增2.2kb的S基因片段,然后插入植物表达载体pBAC176中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记,目的基因以双增强子的CaMV35S(E35S)及其玉米Hsp70第一内含子为驱动。以授粉后10～12d约0.5～1mm大小的玉米幼胚为受体,用基因枪进行转化,经过愈伤组织诱导、草甘膦抗性筛选和分化再生培养,先后获得74株转化再生植株。利用PCR和Southern blot检测表明,T0代转基因苗有9株检测结果为阳性。T1代转基因玉米株系经PCR检测有14个转基因株系为阳性,初步确定了目的基因在这些转基因玉米中的稳定整合。进而通过间接ELISA分析初步确定目的基因在7个T1代转基因玉米株系获得了表达。研究结果为进一步研究表达TGEV-S转基因玉米的生物学活性奠定了基础。     

陆地棉异质型ACCase基因的种子特异表达载体构建与遗传转化

异质型ACCase催化乙酞CoA形成丙二酞辅酶A是植物脂肪酸合成途径中的第一个关键的步骤,也是限速步骤:植物体内过量表达ACCase能够增加脂肪酸合成的底物,有可能导致植株种子含油量的增加.本实验采用GUS基因瞬时表达检测棉花愈伤组织中种子特异性表达启动子AGP的活性;利用RT-PCR扩增,克隆了陆地棉异质型ACCas...     

工业用高油高芥酸转基因油菜株系的获得

芥酸在工业上具有诸多用途,目前主要从菜籽油中制取,提高芥酸含量和含油量是工业专用高芥酸油菜育种的两个重要目标。本研究在甘蓝型油菜高油品种CY2中籽粒特异正向表达拟南芥At FAE1基因,增强脂肪酸延伸酶的活性,获得了两个高油高芥酸转基因株系,其芥酸含量由CY2的43%提高到了60%左右,含油量超过了50%,稍高于CY2。这一研究表明,极长链脂肪酸生物合成关键酶基因FAE1表达的上调不仅能显著促进芥酸合成,而且对提高含油量也有一定作用。田间观察和考种结果显示,两个株系的主要农艺性状与CY2相仿,未发生显著变化。该转基因油菜的产业化开发将有助于降低企业的原材料和芥酸产品的生产成本。     

基于FAE1和FAD2基因的油菜种子脂肪酸生物合成遗传调控

脂肪酸延伸酶1基因FAE1和Δ~(12)-脂肪酸脱饱和酶基因FAD2是植物脂肪酸生物合成途径中的两个关键酶基因,在同一甘蓝型油菜品种CY2中对这两个关键酶基因进行单表达和双表达遗传调控获得五种不同类型的具有相同遗传背景的转基因株系。本研究分析比较了种植于相同环境条件下的五类转基因株系及野生型对照的种子脂肪酸组成和含油量,结果表明,两基因单独和双重调控可显著改变油酸、亚油酸、亚麻酸、花生烯酸和芥酸等多种脂肪酸含量,其中两个内源目标基因同时沉默种子中的油酸含量从20.5%提高到了82.8%,拟南芥FAE1基因籽粒特异表达种子中的芥酸含量由43.9%增加到了60.2%。与野生型对照相比,五类转基因种子中的十八碳不饱和脂肪酸相对比率和油酸脱饱和比例均发生了显著变化。此外,增强FAE1基因表达后种子含油量有所提高,而沉默两个目标基因的表达则使种子含油量降低,表明两个关键酶基因调控对油脂合成与积累也产生一定影响。     

转IPT基因油菜提高抗蚜虫能力

本研究利用农杆菌介导IPT(isopentenyl-transferases,异戊烯基转移酶)基因转化喀斯特特有甘蓝型油菜自交品种S65,在无激素的筛选培养基中获得再生植株14株,PCR检测12株外源基因整合入油菜基因组中.对其中5株转基因植株及5株野生型植株人工接种蚜虫试验,研究超量表达IPT基因油菜对蚜虫的抗性.结...     

细胞穿透肽介导的小黑麦小孢子遗传转化研究

本研究选用小黑麦小孢子作为供试材料,进行细胞穿透肽介导的植物单倍体细胞遗传转化可行性研究。提取单核靠边期的小黑麦小孢子进行悬浮培养,将细胞穿透肽与报告基因GFP的表达框复合物对小孢子进行转化。转化植株进行了PCR分子检测,并在荧光体视显微镜下观察外源GFP基因的表达情况。共获得21株候选转基因植株,其中染色体自然加倍植株为10株。T1代加倍植株的PCR检测结果显示,加倍的转基因株系中有3个株系的PCR检测结果呈阳性。通过荧光体视显微镜可在转基因植株的幼胚部位观测到GFP蛋白的荧光。以上结果表明外源GFP基因已经整合到小黑麦基因组上并且得到表达并稳定遗传。因此,由细胞穿透肽介导的植物单细胞转化是一种有效、可行的植物单细胞转基因方法。     

GUS基因和NPTⅡ基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用

利用农杆菌介导转化法,将含有35S启动子驱动NPTII基因和GUS基因以及棉纤维特异表达启动子E6驱动目的基因FB的植物表达载体转入到常规棉花R15中.重点分析了GUS基因和NPTII基因在愈伤诱导阶段、T0代及T1代转基因棉花中的表达情况.综合两个基因的表达来进行转基因棉花的阳性鉴定,可以为转基因棉花后代的纯合选育提供双重保障.7个转基因株系选育到T3代共获得株行51个,卡那霉素检测多数株行阳性率在90%以上,其中21个株行阳性率达100%.     

棉花脂肪酸合成酶基因GhKAR和GhENR表达载体构建及其功能初探

酮脂酰ACP还原酶(β-ketoacyl-(ACP)reductase,KAR)和烯脂酰ACP还原酶(β-enoyl-(ACP)reductase,ENR)是脂肪酸合成过程中2个关键的还原酶,主要负责脂肪酸碳链的延伸。为明确棉花同源基因的功能,克隆了陆地棉Gh KAR和Gh ENR基因,并构建表达载体;应用花粉管通道法转化棉花,经过PCR检测和Southern杂交,筛选出阳性单拷贝植株,分析其后代株系中目的基因对油分含量以及抗寒性的影响。通过对转基因T4株系含油量的测定,发现转基因株系种子的含油量比野生型对照提高10.2%~14.1%,与对照差异极显著。通过气相色谱法分析转基因株系种子的脂肪酸成分,发现不饱和脂肪酸含量比野生型对照增加4.04%~6.02%。测定4℃低温胁迫下各个转基因株系不同时间生理指标的变化,结果表明:转基因株系的相对电导率和脯氨酸含量积累明显高于对照,而丙二醛含量低于对照,在不同胁迫时间与对照表现出显著或极显著差异,过表达的转基因株系的抗寒性有所提高。     

荧光素酶作为可视标记整株检测转基因玉米

利用活体成像系统检测转基因玉米中荧光素酶信号整株实时筛选高表达的转基因玉米。结果表明,按照信噪比大于2为高表达转基因阳性植株的标准,获得的T1代66株转pMD35LUC的植株中,11株有荧光信号,其中2株信噪比值大于2;获得的T1代68株转化pMDUBLUC的植株中,30株有荧光信号,6株信噪比值大于2。信噪比值大于2的植株移栽成活7株,经PCR检测均为阳性。2株T1植株的T2代植株无荧光信号值;5株T1植株的T2代植株都有数量不等的植株有荧光信号,其中4株T1株都有信噪比值大于2的T2代植株,经PCR检测均为阳性。本研究跳过一系列大量的操作复杂、耗时、高成本的体外分子检测,直观、准确、实时、低成本地淘汰大量非转基因和表达不强的植株或株系,为玉米转基因植株的筛选提供了有效方法。     

水稻OsAPX1基因在烟草中的表达及其抗盐性研究

本研究采用RT-PCR方法克隆得到水稻细胞质抗坏血酸过氧化物酶(OsAPX1)基因全长cDNA(基因登录号:D45423);将该基因构建二元植物表达载体pBI121-OsAPX1;用农杆菌EHA105侵染介导烟草叶盘转化法转基因,获得转基因植株,PCR鉴定遗传转化的烟草植株成功地整合了水稻OsAPX1基因;Northern blot鉴定结果表明转基因T1代植株Ta在mRNA转录水平上表达;对Ta株系进行Kana抗性鉴定,表明转基因T2代株系有抗性;对T2代株系做NaCl、NaHCO3、Na2CO3抗盐性鉴定,结果表明与对照相比表现出转基因植株抗(耐)性提高;取T2代植株的叶片在不同浓度H2O2处理下,抗H2O2毒害的能力显著强于对照,转基因植物的抗性有所提高,有望在抗盐碱性育种上应用.     

花粉管通道法转化大豆的分子表征

采用花粉管通道技术将含有gus基因的pBI121质粒DNA导入辽豆14，从处理的100朵花中获得53粒种子。经PCR检测53粒种子的幼苗，共检测出6株阳性植株。采用RT—PCR和GUS组织化学染色法对所获得阳性植株进行检测，其中2株幼苗(T0代17号和33号)均出现阳性结果，进一步对这2株阳性植株进行Southern blot检测，同样获得了阳性结果。上述检测结果表明，gus基因已整合到染色体上并得到了表达。对转基因植株后代进行了PCR跟踪检测，结果从17号株系的28株中检测出19株阳性植株，33号株系的35株幼苗中检测出17株阳性植株，表明gus基因可以在转基因植株后代遗传。本研究结果为大豆花粉管通道转化技术提供了比较充分的分子生物学证据。     

转基因抗丝黑穗病玉米的遗传、表达及选育研究

本研究以几丁质酶基因导入玉米自交系海92-1所获得的转基因植株的种子作为试验材料,对其To代种子进行了潮霉素抗性筛选试验,结果表明T1代的分离比分别为3:1和15:1(表1).这证实大多数转基因植株中几丁质酶基因是以单拷贝、单位点整合到植株的基因组中,个别转基因植株中是以单拷贝、多位点整合到转基因植株的基因组中的.农艺性状调查分析,转基因株系的株高和穗位高都高于对照植株,单株结穗数基本不变,而转基因植株的穗长值和穗粒数值均比对照植株大,穗长增加4～7 cm,穗粒数增加1%～7%.对T1,T2,T3代株系的PCR检测结果说明目的基因在转基因植株中可稳定遗传.田间抗病鉴定结果显示,转基因株系的发病率比当代对照株系明显减少2～4级,选育得到的纯合系06006和06012的发病率为0,表现出高抗病性.     

对转蚕丝芯蛋白轻链基因棉花的分析

利用根癌农杆菌介导转化法,将棉纤维特异表达启动子GAE6-3A驱动的蚕丝芯蛋白轻链基因（FBN）转入陆地棉R15中。T₀代转基因再生株FNB基因PCR检测阳性率达70%。随机选取4个转基因株系T₁代材料的Southern杂交显示,3个为双拷贝插入、1个为单拷贝插入;Northern分析结果证实FBN基因在转基因棉纤维中表达。转基因后代的纯合选育主要以田间卡那霉素检测结合实验室内GUS组织化学检测进行,其中4个株系已获得了T₃代转基因材料,其他若干个转化子也获得T₁代和T₂代的不同材料。对6个转基因棉花株系后代纤维检测结果表明,蚕丝芯蛋白轻链基因对棉花纤维品质的影响主要体现于对纤维强度的改良。H18、H32、H34株系转基因棉花后代纤维强度较对照显著提高,其中H18纤维强度提高12.3%。     

反义4CL基因调节烟草木质素生物合成

采用根癌农杆菌介导法的叶盘转化法,将紫穗槐反义4CL基因片段导入烟草中,获得T0代阳性转化植株。T0代转基因植株自花授粉,收获种子,种植后获得T1代植株。PCR、RT-PCR(T1代)检测、目的片段测序的结果表明,反义4CL基因已经稳定遗传到T1代中。T1代烟草阳性植株和阴性植株的比例为77:23,接近于3:1。两株T1代烟草转化植株q RT-PCR及4CL酶含量检测表明,叶片4CL1基因表达量较野生植株降低了19.51%;茎4CL酶含量降低了10.50%,说明该反义基因能够干扰烟草4CL基因的表达。T1代烟草茎木质素含量平均下降了11.87%,根木质素含量降低了14.23%。种植60 d的转基因植株与野生型植株生长一致,在株高、株重等方面差异不显著(p0.05),说明反义4CL基因的转入在降低了木质素含量的同时并没有影响烟草的正常生长。     

木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因遗传转化木薯的研究

旨在获得转淀粉分支酶反义SBEⅠ基因的‘华南木薯8号’转基因植株,为利用转基因技术改良木薯淀粉品质打下基础。在建立了木薯从胚状体子叶到完整植株的再生体系的基础上,用块根特异表达启动子Sporamin驱动的木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因,通过农杆菌介导法对‘华南木薯8号’进行遗传转化。共接种‘华南木薯8号’子叶517块,获得7株生长良好的转化再生植株,转化再生频率达到1.35%。经PCR检测,其中5株转化再生植株扩增出目的条带,初步证实木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因已整合进了‘华南木薯8号’基因组中。通过农杆菌介导法可以将淀粉分支酶SBEⅠ反义基因导入到‘华南木薯8号’基因组中,获得了5株转基因植株。     

木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因遗传转化木薯的研究

旨在获得转淀粉分支酶反义SBEI基因的‘华南木薯8号’转基因植株,为利用转基因技术改良木薯淀粉品质打下基础。在建立了木薯从胚状体子叶到完整植株的再生体系的基础上,用块根特异表达启动子Sporamin驱动的木薯淀粉分支酶SBEI反义基因,通过农杆菌介导法对‘华南木薯8号’进行遗传转化。共接种‘华南木薯8号’子叶517块,获得7株生长良好的转化再生植株,转化再生频率达到1.35%。经PCR检测,其中5株转化再生植株扩增出目的条带,初步证实木薯淀粉分支酶SBEI反义基因已整合进了‘华南木薯8号’基因组中。通过农杆菌介导法可以将淀粉分支酶SBEI反义基因导入到‘华南木薯8号’基因组中,获得了5株转基因植株。     

抗草甘膦基因的玉米转化及后代遗传分析

利用农杆菌介导法将一个新型抗草甘膦基因导入玉米优良再生材料Hi-II中,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在15株T0转基因植株中有10株,经PCR初步检测呈阳性;T1转基因植株用2%草甘膦进行抗筛选性后,4个穗行符合3:1的遗传分离比,3个穗行符合1:1的遗传分离比.对35个T2转基因植株以株系为单位混收...     

小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析

目前已克隆出许多类甜蛋白基因并成功转化马铃薯、水稻和小麦等植物,均可引起植株抗病性的提高。在以往的研究中我们从小麦中克隆了一个类甜蛋白基因(Ta-Tlp),该基因在高抗白粉病的小麦6VS/6AL易位系中能够高水平表达,推测它与白粉病抗性密切相关。为进一步研究该基因的功能,本研究构建了包含在ubi强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,用基因枪将其导入小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织,在含除草剂的选择培养基上经两轮筛选和分化,获得再生抗性植株。对T0、T1和T2代植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,结果表明Ta-Tlp基因已整合进受体基因组并且能够表达。对T0代及其衍生的T1代(来自6个T0代阳性株系的183个单株)和T2代(来自6个T0代阳性株系的241个单株)转化植株进行白粉病抗性鉴定,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,其白粉病抗性有一定提高。对T2代阳性转化植株进行赤霉病抗性鉴定表明,其抗性与受体对照相比无显著差异。