石榴CBF基因家族的鉴定及响应冷胁迫的表达模式

冷胁迫是限制石榴生产的主要非生物胁迫之一。C-repeat binding factors (CBFs)是一种可被快速诱导的关键信号基因,在植物的低温应答中起着至关重要的作用。然而,CBF家族在石榴中尚未阐明,该家族在低温诱导条件下的表达模式尚不清楚。本研究在石榴基因组中鉴定了7个Pg CBF家族基因,并分析了它们的蛋白保守结构域、蛋白理化性质、基因结构、系统进化、启动子顺式作用元件以及低温诱导条件下的表达模式。结果表明,7个Pg CBF蛋白均具有AP2/ERF结构域;7个PgCBF基因分布在1号(5个)和4号(2个)染色体;系统进化分析发现,7个Pg CBF蛋白分为3个亚类;启动子顺式作用元件分析发现,石榴CBF可能参与激素响应、非生物胁迫响应过程。冷胁迫处理下,除PgCBF4外,其余6个PgCBF基因均被显著诱导,表明PgCBF基因参与响应冷胁迫生物学过程,本研究为后续深入开展石榴抗性分子设计育种研究提供一定理论基础。     

中国辣椒低温响应转录因子CBF全基因组鉴定与分析

CBF (C-repeat binding factor)转录因子在植物应对低温等非生物胁迫和提高耐寒性中发挥着重要作用。为了探究中国辣椒(Capsicum chinense Jacq.) CBF基因家族的基本特性,利用生物信息学方法,在中国辣椒基因组中鉴定获得8个CBF基因家族转录因子,对其理化性质、蛋白结构、系统发育、作用元件和基因转录进行了分析。结果表明,8个CBF蛋白长度为156～290 aa,蛋白分子量为17.75～32.21 kD;这些蛋白均包含AP2结构域。系统发育分析表明,中国辣椒8个CBF基因可分为两个亚组,其中A组包含7个基因,B组仅包含1个基因。表达分析表明,8个CBF基因对低温冷胁迫均有不同程度的响应。研究结果概括了中国辣椒CBF基因家族的基本特性,为CBF转录因子的深入研究和应用积累了基础数据。     

海岛棉5个CBF/DREB基因的克隆与表达分析

低温、干旱和盐渍是影响作物生长、产量和全球地理分布的重要非生物胁迫。CBF/DREB转录因子是参与植物非生物胁迫应答反应的重要调控蛋白。为了更好地了解棉花CBF家族基因,通过生物信息学的方法,从海岛棉中克隆了5个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Gb CBF1―Gb CBF5。这5个基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的保守性,含有1个AP2功能结构域和2个特征基序。系统进化树分析表明,这5个基因与拟南芥的3个参与冷胁迫的CBF基因一起聚类在DREB亚家族中的A-1亚组。通过RT-PCR的方法分析了海岛棉基因Gb CBF1―5在高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、干旱、4℃低温等非生物胁迫处理下的表达模式。结果表明其中2个基因在冷胁迫下上调表达,5个基因在干旱和盐处理下均下调表达。这些为进一步探索CBF基因在棉花逆境胁迫应激反应中的作用提供了有价值的信息。     

胡杨F-box基因克隆和功能分析

F-box蛋白在泛素-蛋白酶体途径中能够特异识别底物蛋白,调节多种激素的信号转导途径,并响应多种非生物胁迫,参与植物抗逆途径。胡杨(Populus euphratica)是中国西北沙漠唯一能成林的高大乔木树种,对盐碱、干旱、极端温度等抵抗能力较强,是研究林木抗逆机理的候选模式树种。本研究对胡杨耐盐性状关联分析获得的F-box基因进行克隆、表达特性分析、亚细胞定位和转化胡杨原生质体的耐盐性测定,旨在研究胡杨F-box基因的功能特性。胡杨F-box基因全长1 086 bp,编码361个氨基酸,含有一个F-box domain和一个F-box associated domain。q RT-PCR表明胡杨F-box基因在各组织中均有表达,无组织特异性,其表达受盐、高温、低温、干旱和ABA胁迫诱导。PEG介导的胡杨原生质体瞬时表达发现F-box蛋白定位于细胞核上,流式细胞术证实过表达F-box基因能够提高胡杨原生质体的耐盐性。研究初步揭示了胡杨F-box基因的表达特性和耐盐性,为进一步解析胡杨F-box基因的功能及胡杨抗逆分子机理提供帮助。     

玉米中低温应答ERF基因鉴定及表达分析

ERF转录因子在植物的多种发育过程和非生物胁迫反应中发挥重要作用。在玉米中,虽然ERF家族基因对盐胁迫和干旱胁迫的响应研究已经有报道,但尚没有研究从全基因组水平鉴定ERF家族基因对低温胁迫的响应。本研究采用高通量测序技术Illumina HiSeq,分别在5℃和22℃处理下构建玉米叶组织转录组,从中筛选出57条低温响应ZmERFs,包括53条上调表达的Zm ERFs,4条下调表达的Zm ERFs。不同的Zm ERFs在不同组织部位和发育阶段的表达模式有很大变化。蛋白保守结构域分析表明ZmERFs蛋白中共有20个保守基序,EAR基序出现在组B1成员中,LWSY基序出现在A1,A5和B2成员中。启动子分析显示,多种逆境相关元件ABRE、ARE、LTR和MBS在低温响应ZmERFs的启动子中高度富集。RT-qPCR结果进一步显示GRMZM2G544539和GRMZM2G040664基因可以同时受低温、盐和干旱胁迫诱导表达,GRMZM2G434203基因可以同时受低温和干旱胁迫诱导表达,表明ERF转录因子可以参与包括低温在内的多重非生物胁迫反应。此外,启动子中含有7个ABRE元件的GRMZM2...     

白菜脱水应答转录因子BpDREB1基因的克隆及功能研究

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用,利用这些基因改良作物抗逆性具有重要意义。本研究在白菜中分离到一个DREB类转录因子基因BpDREB1 (EF219470)。该基因序列全长647 bp,推测编码蛋白含213个氨基酸,相对分子量为23 kD,理论等电点为5.11,与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。进化树表明,BpDREB1属于DREB亚家族中A1亚族。基因的诱导表达模式分析显示,BpDREB1被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐处理几乎没有响应。过表达BpDREB1的转基因拟南芥经低温诱导后,其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示BpDREB1转录因子基因具有家族成员基因结构的特征,在低温、干旱应答途径中起重要作用。     

拟南芥NSP家族基因序列分析及响应干旱胁迫表达分析

芥子油苷是十字花科植物中的一种重要的次生代谢产物,它被酶水解的降解过程与植物响应逆境胁迫有关。NSP蛋白是一类能与黑芥子酶结合从而改变芥子油苷降解途径最终生成腈类物质的特异蛋白,其与ESP家族蛋白在功能上存在冗余。本研究以拟南芥NSP家族基因为对象,对家族成员基因序列、蛋白质序列、启动子序列进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术检测了该家族基因在干旱胁迫下的表达量。结果表明:该家族成员基因分布于3条染色体上,外显子数目2～4个;AtNSP5蛋白亚细胞定位于细胞核,其他成员定位于细胞质;结构域预测显示,该家族蛋白均含有4个Kelch结构域,除AtNSP5外,其他四个成员还含有1～2个Jacalin结构域;启动子序列中均含有CAAT-box、TATA-box核心元件及数量不一的逆境响应元件;干旱胁迫表达量分析显示,该家族中AtNSP5基因受干旱胁迫诱导表达,其他成员响应干旱胁迫不显著。本研究为进一步研究NSP蛋白在植物响应干旱胁迫中的分子机制提供依据,并为植物抗旱基因工程提供潜在候选基因。     

烟草SnRK2基因家族的克隆及表达分析

农作物生产过程中会面临多种非生物胁迫的影响,会极大地影响作物的产量以及品质。非生物胁迫形式多种多样,干旱胁迫是其中一种主要形式。烟草是重要的经济作物,主要在中国西南地区种植,但经常会遭受极端干旱胁迫。Sn RK2基因家族参与植物抗旱过程,能够受逆境胁迫诱导表达,这种表达是SnRK2基因家族功能的重要体现。为了进一步研究烟草SnRK2家族基因的功能,本研究克隆了烟草SnRK2基因家族GroupⅠ的基因,并检测了烟草SnRK2基因家族的组织表达特异性及诱导表达特异性。结果表明,烟草SnRK2基因中Ntab0922420基因的表达量最高,同时烟草SnRK2基因家族成员更容易在茎与叶中表达。烟草经过低温、盐、干旱胁迫以及ABA处理后,部分SnRK2基因成员表现出受胁迫诱导,其中ID为Ntab0894060的基因受干旱显著诱导。这些工作将为研究烟草SnRK2基因家族功能鉴定基础,并为培育抗逆烟草品种提供遗传资源。     

大白菜NPR家族基因鉴定及表达模式分析

为明确大白菜NPR转录辅助因子在大白菜基因组中的数量、结构和表达特点,揭示NPR在水杨酸信号途径调控大白菜生长发育过程中的作用。本研究利用拟南芥资源信息库TAIR10和芸薹属基因组网站Brassica Database鉴定大白菜基因组中的NPR家族成员,并对其蛋白和基因特性进行生物信息学分析。鉴定出大白菜基因组中包括11个NPR家族基因,分别定位在大白菜7条染色体上,具有1~5个外显子不等。BrNPR家族蛋白可聚类为6个分支,包含11个保守元件,并且所有BrNPR家族成员均含有DUF和Ank两个保守结构域,其中BrNPR1-4成员基因的编码区均含有核定位信号(NLS)。基因表达模式检测结果表明部分大白菜NPR基因在不同组织中具有组织特异的表达模式,BrNPR1B在根、茎和叶及BrNPR3B在花和种荚中表达显著,绝大部分BrNPR基因受盐胁迫诱导表达,部分BrNPR基因受根肿菌侵染诱导表达。本研究可为后续大白菜NPR基因的功能验证提供依据。     

新疆野扁桃CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析

CBF基因主要功能是调控下游大量抗冷基因的表达。CBF基因是植物抗冷途径的枢纽,对增强植物的抗冷能力极为重要。本研究利用染色体步移法得到了新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schleche)CBF基因家族成员Als CBF翻译起始位点上游的启动子序列,长度为1 391 bp(Gen Bank登录号:KP662710)。对启动子序列进行生物信息学分析表明,该序列存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,并且含有多个与植物非生物胁迫有关的响应元件:ABA响应元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件和LTRE低温应答元件等。在烟草叶片中进行瞬时表达的结果表明,该启动子序列具备在逆境胁迫下诱导驱动报告GUS基因表达的功能。本研究可为揭示CBF基因在野扁桃抗寒性、抗旱性等抗逆过程中的作用机理,以及为增强野扁桃CBF基因在扁桃的抗逆性遗传改良中的作用奠定一定的基础,同时对野扁桃的繁育和保护也有极为重要的意义。     

藜麦CAT基因家族的鉴定

为探讨过氧化氢酶(Catalase, CAT)在藜麦基因组中的结构和表达特点,分析CAT在藜麦耐受逆境胁迫机制中的作用,本研究从藜麦基因组中鉴定出4个可分为2个亚组的CAT基因家族成员。系统进化树显示藜麦CqCAT基因家族成员的基本特征在单双子叶植物分离之前就已形成。该家族成员的二级结构主要特点为:由α-螺旋和无规则卷曲组成;含20种以上氨基酸,存在10种不同的保守基序。基因启动子区域共预测到响应脱落酸、茉莉酸、水杨酸、低温和干旱等11种相关的顺式作用元件。RNA-seq分析表明该家族成员具有组织特异性表达。RT-qPCR分析表明CqCAT基因受NaCl和干旱胁迫诱导表达,同时CAT酶活性也表现为上调。推测藜麦CqCAT基因可能参与多种胁迫的响应过程,其高表达可能提高藜麦的耐盐能力,研究结果可为进一步研究藜麦CqCAT基因家族的功能提供依据。     

四个苹果MdCBF基因克隆与表达分析

为了筛选出苹果中的抗冻负调控基因,培育抗冻苹果新品种奠定基础,通过生物信息学的方法从苹果中克隆了4个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Md CBFL1~Md CBFL4。通过与其他植物CBF/DREB蛋白氨基酸序列的多重比对发现,这4个蛋白具有CBF蛋白典型的结构特点,即1个AP2结构域,2个特征序列,即核定位信号区PKRPAGRTKFRETRHP和DSAWR保守序列。从系统进化树中可以看出苹果Md CBFL1~Md CBFL4蛋白与At DREB1蛋白聚在A-1亚族,推测它与拟南芥A-1转录因子功能相似,Md CBFL1~Md CBFL4蛋白表达受干旱、盐碱、低温等逆境胁迫的诱导。采用半定量RT-PCR的方法检测分析苹果中Md CBFL1~Md CBFL4基因在高盐(200 mmol/L Na Cl)、干旱和低温处理下基因的表达情况,结果表明,Md CBFL1基因对低温、干旱、盐胁迫3种逆境胁迫均有一定程度的响应,Md CBFL2~Md CBFL4基因受低温与高盐的诱导。为进一步阐明苹果Md CBF基因在逆境应答中的功能、机制提供了有益线索。     

水稻DUF966基因家族的生物信息学分析

DUF966基因家族是一类未知功能的基因家族,它们在水稻生长发育和逆境胁迫应答反应中可能起重要作用,为了研究这些基因的生物学功能,初步揭示它们对水稻生长发育和抗逆性的调控作用,本研究通过生物信息学方法,分析了水稻DUF966家族基因特征、系统进化、芯片表达谱、跨膜结构域、信号肽以及亚细胞定位。结果表明,水稻DUF966基因家族包含7个成员,几乎都具有转录活性,它们编码的蛋白质只包含1~2个保守的未知功能结构域(DUF966结构域);进化分析表明,该家族可分为4个亚群,其中Os DSR2、Os DSR4、Os DSR5和Os DSR6同属一个亚群,可能具有相似的生物学功能;芯片表达谱分析表明,该家族基因主要在幼苗、花序和茎中呈中、低度表达,Os DSR3和Os DSR7基因受盐和低温胁迫的诱导表达,其它基因受不同非生物胁迫的抑制表达,该家族多数基因还能被白叶枯病菌侵染诱导表达;蛋白预测表明,该家族蛋白不含跨膜结构域和信号肽序列,能够被定位在细胞质中。本研究为系统开展水稻DUF966基因家族的生物学功能研究提供了依据。     

耐低温萌发棉花品种种子萌发期生理特性分析

为探讨低温胁迫下不同棉花品种萌发差异成因,以强耐低温萌发品种鲁棉研37号、鲁棉研36号和低温萌发敏感品种斯字棉2B、斯字棉5A为材料,研究了不同低温下不同萌发时期的生理指标与基因表达的差异。结果显示,12℃胁迫36 h,低温萌发敏感品种MDA含量急剧上升,至胁迫48 h,低温萌发敏感品种斯字棉2B、斯字棉5A比鲁棉研37号MDA含量分别提高了48. 17%,50. 65%,因此,12℃胁迫36 h MDA含量的变化可以作为耐低温萌发的选择指标; SOD、POD活性在各种处理水平下鲁棉研37号、鲁棉研36号均保持较高水平; CAT活性在低温的刺激下,强耐低温萌发品种逐渐超越低温萌发敏感品种;游离脯氨酸含量在12℃胁迫48 h时,鲁棉研37号与斯字棉2B、斯字棉5A相差幅度分别为33. 32%,23. 27%,这些生理指标差异较好地反映了不同品种耐低温萌发差异。4个CBF基因家族成员CBF1、CBF2、CBF4、CBF6在强耐性品种中表达上调更迅速,在胁迫12 h时达到表达峰,这可能是强耐低温萌发品种应答低温胁迫时,表现更灵敏与迅速的原因。     

番茄冷诱导基因SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究

从番茄中克隆了一个编码MYB转录因子家族R2R3-MYB亚类基因SlCMYB1。不同逆境胁迫下的表达模式分析结果表明,该基因受低温、高盐、干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明,SlCMYB1为核定位蛋白。为深入了解SlCMYB1基因与非生物逆境应答的关系,我们构建了SlCMYB1基因过表达载体来转化水稻,获得了16个转基因水稻株系。SlCMYB1在水稻中异源表达能显著提高转基因水稻植株的苗期抗冷性,增加脯氨酸合成的关键酶基因OsP5CS1,膜转运蛋白基因OsWCOR413等低温胁迫应答基因的表达水平,这暗示着SlCMYB1与OsP5CS1、OsWCOR413基因处于同一低温调控信号转导路径。本研究结果为通过遗传工程操控低温信号通路的方法改良冷敏感植物抗冷性提供了理论基础。     

水稻膜联蛋白基因OsAnn8干旱和低温条件下表达模式以及CRISPR/Cas9定点编辑

为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。     

水稻CNGCs家族的鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

为了解水稻CNGCs家族成员的基因结构、进化特征、亚细胞定位、启动子顺式作用元件和生物学功能,本研究利用生物信息学的手段对水稻CNGCs家族进行鉴定,运用RT-qPCR的方法分析OsCNGCs在非生物胁迫下的诱导表达模式。结果表明,水稻共有16个CNGCs,分布在1、2、3、4、5、6、9和12号染色体上。进化树分析显示OsCNGCs可分为4个大组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ),而Ⅳ组可以细分为Ⅳ-A和Ⅳ-B 2个亚组。OsCNGCs启动子区域存在多种顺式调控元件,包括各种类型的光响应元件、厌氧诱导响应元件、逆境相关转录因子结合元件、防御和逆境响应元件、低温响应元件以及各种植物激素响应元件等,暗示OsCNGCs在响应多种激素和非生物胁迫中可能存在重要调控作用。多种非生物胁迫诱导表达分析表明,大多数OsCNGCs基因表现出明显的差异表达。本研究为解析CNGCs家族基因在水稻应对非生物胁迫中的功能提供了参考。     

辣椒Whirly基因家族的鉴定及表达分析

为了探索辣椒Whirly基因家族成员的功能和进化关系,通过生物信息学分析了其基因结构、保守基序、进化关系及表达模式,通过荧光定量PCR测定其在脱落酸、高温、低温、疫病等胁迫下的表达量。结果表明,从辣椒CM334中鉴定了2个Whirly基因家族成员,CaWHY1和CaWHY2。辣椒CaWHY1和CaWHY2同其他物种Whirly基因理化性质相比,差别不大,结构相似性高,CaWHY2基因和番茄的SlWHY2基因结构完全一样,在系统进化树中聚在一起。CaWHY1与SlWHY1聚在一起,但它们的基因结构不同,说明Whirly蛋白在进化过程中,结构保守。表达模式分析发现,CaWHY1和CaWHY2在辣椒CM334中均能表达,但在不同组织和果实发育时期的表达水平存在差异。CaWHY1和CaWHY2在不同胁迫处理下受到不同程度的诱导,其中CaWHY1明显受疫病的诱导,CaWHY2在低温处理和脱落酸胁迫下的表达量变化趋势相反。由此可知,Whirly基因家族在辣椒的生长发育中起调控作用,在各种逆境胁迫中也发挥一定作用。