谷子CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析

CBL/CIPK信号网络系统在植物对逆境应答过程中起重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出7个候选CBL基因,命名为SiCBL1~SiCBL7。分析表明谷子CBL基因在蛋白质序列和结构上非常保守,所有预测SiCBL基因都含有7~8个内含子,而且其外显子序列同源性很高并且大部分外显子含有相同的碱基数目。预测SiCBL基因均含有4个EF-Hand功能域而且相邻EF-Hand功能域之间的氨基酸数目非常保守。进化和聚类分析结果表明, CBL基因在陆生植物早期的进化过程中就已经存在,所有CBL基因被分为4个亚组。7个候选SiCBL基因中, 4个基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3和SiCBL5)受干旱胁迫诱导表达,3个(SiCBL1、SiCBL3和SiCBL7)受高盐胁迫诱导表达。SiCBL3基因在干旱胁迫下被强烈诱导可能意味着其在干旱应答中起重要作用。本文报道的谷子CBL基因丰富和完善了植物CBL成员, 为进一步研究CBL/CIPK网络系统在抗逆作物谷子逆境响应中的功能、机制奠定了基础。     

番茄CBL家族基因的鉴定和遗传进化分析

植物CBL基因在逆境应答过程具有重要功能,但在番茄中缺乏相关报道。本研究利用生物信息学的方法从番茄基因组中鉴定出13个CBL基因,并对它们的基因组分布、分子特征、遗传进化以及顺式元件等进行了分析。结果发现,番茄CBL基因在基因组中的分布是不均匀的,外显子数大多为8或者9,编码区序列大小在561~774 bp之间。在进化上番茄CBL基因分为两个不同的类群;它们编码的蛋白除了一个预测定位在胞外基质中,其余定位在细胞的不同部位;在番茄CBL基因的上游序列中存在几个或者多个应答不同逆境和植物激素的顺式元件,而且不同成员含有的顺式元件的种类和数目各不相同。上述分析显示番茄CBL可能参与多种生物学过程,而且不同成员存在功能上的分化。本研究结果可为进一步研究番茄CBL基因的功能提供有益参考。     

林烟草NsylCBL10互作蛋白激酶NsylCIPK的鉴定与分析

植物中的类钙调神经素B亚基蛋白CBL (calcineurin B-like protein)家族成员与其互作蛋白激酶CIPK (CBL-interacting kinase protein)家族成员形成了复杂精细的CBL-CIPK信号调控网络,在解码生物和非生物胁迫激发的钙信号及信号的进一步传导中发挥重要作用。CBL家族成员CBL10参与植物抵抗高盐胁迫、应对病菌侵染、参与分生组织和花器官发育、调节离子平衡等多个过程,对其下游互作CIPK家族成员的筛选与鉴定对于明确上述调节机制至关重要。为了鉴定林烟草(Nicotiana sylvestris) NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成员,本研究首先以拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtCIPK家族成员和水稻(Oryza sativa) OsCIPK家族成员基因的CDS序列为检索序列,利用NCBI和中国烟草基因组数据库对林烟草中可能存在的NsylCIPK家族成员进行了预测;然后通过RT-PCR方法对预测到的NsylCIPK家族成员进行了克隆并利用生物学分析软件对其基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;最后通过酵母双杂交实验鉴定了与Nsyl CBL10互作的NsylCIPK家族成员。结果表明,在林烟草中可能存在28个NsylCIPK家族成员,实际克隆获得了20个NsylCIPK家族成员,在酵母双杂交体系中与NsylCBL10互作的只有1个NsylCIPK家族成员Nsyl CIPK14a。本研究为解析林烟草及其他物种中CBL-CIPK信号通路的调节功能提供了试验数据。     

林烟草中与蛋白激酶NsylCIPK24a互作的NsylCBL蛋白家族成员的筛选鉴定

植物CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,该家族成员通过与上游的CBL蛋白(Calcineurin B-like protein)互作,形成CBL-CIPK信号系统,参与调控植物的生长发育和逆境胁迫响应过程。早期研究发现,拟南芥AtCIPK24分别通过与AtCBL4和AtCBL10互作,激活下游靶蛋白的活性,应对高盐胁迫。本研究前期从林烟草中获得了1个与拟南芥AtCIPK24同源的基因NsylCIPK24a,但与其互作的CBL家族成员及该激酶的具体功能尚不清楚。因此,本研究对林烟草CBL家族成员进行了全基因组预测;利用RT-PCR方法克隆CBL家族成员,并对其基因结构、蛋白保守结构域及组织表达情况进行了分析;通过酵母双杂交试验鉴定与NsylCIPK24a互作的林烟草CBL家族成员。结果表明,林烟草中共预测并克隆获得12个CBL家族成员;NsylCBL4、NsylCBL5、NsylCBL9和NsylCBL10 4个成员可与NsylCIPK24a在酵母中产生互作。推测烟草中可能也存在与拟南芥类似的应对盐胁迫的CBL-CIPK响应路径。本研究为解析林烟草NsylCIPK24a的功能、加深人们对烟草中CBL-CIPK调控通路的理解提供了研究数据。     

植物CBL-CIPK信号通路响应非生物胁迫作用机制的研究进展

环境胁迫是阻止植物生长和发育的关键性因素。类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBLs与其互作蛋白激酶CIPKs组成的CBL-CIPK信号系统是一种基本的钙感受器,在感知不利的环境条件时起到重要的作用。近几年,CBL-CIPK复合体的研究主要集中于逆境条件下其如何调控下游靶点,例如:离子通道和转运蛋白。文章主要对CBL和CIPK家族的结构特征、CBL-CIPK复合体抵御环境胁迫和植物激素应答的研究进展进行了综述,并对未来CBL-CIPK信号系统研究的重要方向做出了展望。     

木薯MeCIPK1基因克隆及表达分析

CIPK蛋白是一类植物特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,已在多个物种中被证实参与逆境胁迫应答。本研究利用PCR技术从木薯栽培种KU50中克隆得到一个CIPK家族基因,命名为Me CIPK1,该基因的开放阅读框全长为1 137 bp,编码379个氨基酸。生物信息学分析表明Me CIPK1蛋白含有CIPK家族保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和NAF结构域,与橡胶树和麻疯树中的氨基酸序列同源性最高。利用荧光定量PCR研究Me CIPK1在多种处理下的表达模式,结果表明Me CIPK1在转录水平受到ABA、高盐胁迫、干旱胁迫和低温的抑制作用,同时受到氧化胁迫的诱导作用,故此推测Me CIPK1在木薯应答多种非生物胁迫的过程中可能会发挥重要作用。本研究结果为后期深入分析木薯Me CIPK1基因的功能提供理论基础。     

谷子F-box家族基因的鉴定、分类及干旱响应

蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动对维持植物正常生长发育和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性本研究根据谷子转录组分析结果从个家族成员中鉴定出个在干旱胁迫下表达量上调的基因根据序列相似性将其分为类同一类基因具有相似的内含子外显子结构染色体定位分析发现这些基因分别分布在谷子的条染色体上其中第条染色体上含基因最多有个。结构域分析结果表明个蛋白均含保守的结构域而端含、、、、和等结构域。启动子元件分析表明谷子个基因均含逆境应答元件其中和元件的数量最多个说明这些基因对干旱应答反应可能主要受、转录因子调控。转录组分析结果表明基因对干旱胁迫的响应远远高于其他成员对干旱、高盐、、和都有响应亚细胞定位结果显示蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解基因的功能提供了依据。F-box蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动, 对维持植物正常生长发育a和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性, 本研究根据谷子转录组分析结果, 从525个F-box家族成员中鉴定出19个在干旱胁迫下表达量上调的F-box基因; 根据序列相似性将其分为6类, 同一类基因具有相似的内含子-外显子结构; 染色体定位分析发现, 这些基因分别分布在谷子的8条染色体上, 其中, 第2条染色体上含F-box基因最多, 有6个。结构域分析结果表明, 19个F-box蛋白均含保守的F-box结构域, 而C端含FBD、WD40、FBA、ZnF、Kelch和LRR等结构域。启动子元件分析表明, 谷子19个F-box基因均含逆境应答元件, 其中, MYB和MYC元件的数量最多(9~78个), 说明这些基因对干旱应答反应可能主要受MYB、MYC转录因子调控。转录组分析结果表明, SiF-box18基因对干旱胁迫的响应远远高于其他F-box成员, 对干旱、高盐、ABA、SA和JA都有响应; 亚细胞定位结果显示, SiF-box18蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解SiF-box18基因的功能提供了依据。     

辣椒14-3-3蛋白基因家族全基因组鉴定与表达特征分析

14-3-3蛋白(GRF)基因家族通过与靶蛋白相互作用,广泛参与植物激素信号转导和生理代谢过程,在植株生长发育和逆境响应中发挥重要作用。本研究以辣椒(Capsicum annuum)为材料,利用生物信息学研究方法,鉴定得到15个辣椒14-3-3基因家族成员,命名为CaGRF1～CaGRF15。系统分析了CaGRF基因家族成员的结构、进化关系、启动子顺式作用元件、组织及冷胁迫表达,并对CaGRF蛋白互作网络进行预测。结果表明,根据进化关系CaGRF家族成员被分为ε类和非ε类,ε类CaGRF含有更多外显子和内含子;启动子序列分析发现CaGRF启动子中有多个响应激素、胁迫、光的顺式作用元件;表达分析表明CaGRF各成员在辣椒各组织和冷胁迫响应中特异性表达;蛋白互作网络预测发现CaGRF可能与氮代谢、质子转运、转录调控相关蛋白互作。本研究为深入研究辣椒14-3-3家族成员功能及调控途径提供了参考。     

拟南芥钾吸收调控基因AtCIPK23、AtCBL9和AtAKT1农杆菌介导共转化甘蔗

本研究通过农杆菌介导方法将拟南芥调控钾离子吸收的三个重要基因At AKT1、At CBL9和At CIPK23共转化到甘蔗品种粤糖00-236中,以期提高甘蔗耐低钾能力。PCR分析结果表明共获得36份携带At CBL9、At CIPK23和At AKT1三个基因的转基因无性系;Southern blot分析结果表明外源At CBL9基因在甘蔗基因组中的拷贝数为2~5个;在钾离子浓度为200μmol/L的营养液中进行低钾胁迫试验,转基因品系的根系和地上部的平均钾含量分别比对照高37%和23%,叶片平均相对电导率比对照低6%,说明超表达At CIPK23、At CBL9和At AKT1显著提高了甘蔗耐低钾胁迫能力,降低了因低钾胁迫造成的质膜伤害,是创制耐低钾甘蔗种质的有效途径。     

玉米SAMS家族基因鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析

S-腺苷甲硫氨酸合成酶是植物代谢中的一个关键酶,它催化ATP与甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸。利用生物信息学方法系统分析了玉米基因组中的4个S-腺苷甲硫氨酸合成酶(ZmSAMS)成员的参数特征,结果表明4个ZmSAMS成员参数非常接近。不同物种SAMS序列比对及进化分析显示植物SAMS基因在进化过程中具有非常保守的序列和结构。启动子顺势元件预测和蛋白功能分析显示ZmSAMS基因成员可能参与逆境应答、调控转录调控、信号转导、免疫应答等生理生化过程。随后的Real-time PCR验证了ZmSAMS家族基因成员参与了干旱、高温、低温、盐和ABA等逆境胁迫应答。因此推测玉米ZmSAMS基因可能在玉米的逆境胁迫应答中起一定作用。本研究为进一步阐明玉米ZmSAMS家族基因在逆境应答中的功能、机制提供了有益线索。     

小桐子SnRK2基因家族的全基因组鉴定及特征分析

蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶2(sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 2,Sn RK2)属植物特有的一类Ser/Thr类蛋白激酶,参与植物体内多种信号转导途径及逆境胁迫的应答。基于小桐子基因组数据,利用生物信息学的方法鉴定到7个小桐子Sn RK2基因家族成员,并对其从系统进化、理化性质、基因结构及顺式作用元件等进行了分析。结果表明,小桐子Sn RK2基因在进化上较为保守,并聚类为3个亚家族。基因结构包含9~10个外显子,编码的蛋白序列都鉴定到典型的激酶结构域以及C末端酸性补丁区域。同时,在Sn RK2基因上游调控区域都鉴定到多个激素与逆境应答元件。表达分析显示,Sn RK2.1、Sn RK2.2在低温处理下上调表达显著,经过干旱处理,7个小桐子Sn RK2基因在叶中都上调表达,而Sn RK2.1、Sn RK2.2、Sn RK2.5上调表达量达到极显著水平(p0.01)。本研究为进一步的克隆小桐子Sn RK2基因以及研究其在信号转导与激素、逆境应答中的功能提供了参考。     

亚砷酸盐胁迫下水稻microRNA的应答功能及调控通路分析

为明确砷胁迫下microRNA的应答功能及调控通路,本研究利用miRNA芯片检测水稻幼苗在亚砷酸盐胁迫后miRNA的表达差异。结果发现11个miRNA表达显著下调,7个显著上调,并采用RT-PCR验证了9个miRNA的差异表达。差异miRNA靶基因多编码转录因子以及重金属响应网络中的蛋白。基因本体(GO)和KEGG通路富集表明,砷胁迫下miRNA主要介导调控激素信号转导、硫代谢、氨基酸代谢和抗氧化防御。利用PLACE数据库发现miRNA上游启动子区密集分布多种金属应答元件。本研究有助于阐明水稻中砷转运和积累的分子机制,为水稻抗逆育种提供理论参考。     

谷子丙酮酸磷酸双激酶基因(SiPPDK1)对非生物逆境的响应

通过序列比对在谷子基因组中鉴定出一个PPDK基因,命名为Si PPDK1。为揭示该基因对逆境胁迫的响应,本研究通过对Si PPDK1的基因结构、蛋白特征、功能、启动子区域顺势元件、亚细胞定位、进化特征等进行了系统的分析和预测。荧光实时定量PCR检测了该基因在苗期不同逆境、关键生育期干旱以及不同光照条件下的表达。结果表明该基因位于谷子9号染色体,含有17个内含子,有2个可变剪切。功能域分析和多序列比对发现Si PPDK1蛋白具有非常保守的序列结构,并且与其它植物PPDK蛋白非常相似。q RT-PCR表达谱分析表明Si PPDK1基因在苗期被PEG、ABA、Na Cl和低温胁迫强烈诱导。进一步研究表明Si PPDK1基因在拔节、抽穗和灌浆期干旱和不同光照强度条件下均参与了对干旱和光照的胁迫响应,推测该基因参与了谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期干旱和光照胁迫应答中起重要作用。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

两个谷子CIPK基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

CIPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出2个CIPK基因, 命名为SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因组序列长1994 bp,编码451个氨基酸;SiCIPK16基因组序列长1885 bp,编码473个氨基酸,2个基因均无内含子和可变剪切。生物信息学分析显示这2个基因在蛋白质序列和结构上与其他物种CIPK基因一样非常保守。实时定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低温、高温、干旱、高盐诱导下表达量均有所上调, SiCIPK6基因在ABA、干旱和盐处理时表达量上调幅度较大,而SiCIPK16基因在低温、干旱和高温处理时表达量上调幅度较大。半定量PCR检测结果表明SiCIPK6和SiCIPK16两个基因在拔节、孕穗、灌浆期时均有表达,在相应生育时期受到干旱胁迫时它们表达量均有所提高。推测SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境胁迫中起一定作用。     

谷子PPDK2在非生物逆境胁迫下的表达分析

谷子是具有抗旱、耐瘠、抗逆性强、适应性广等特点的C_4禾本科作物,发掘谷子高光效、逆境相关基因,旨在揭示谷子在光照和逆境胁迫下的基因表达特征。采用生物信息学方法,在谷子中鉴定出一个PPDK基因,命名为SiPPDK2;该基因位于谷子3号染色体,含有18个内含子,有3个转录本,原始转录本编码945个氨基酸。亚细胞定位预测结果显示,该基因位于叶绿体中。功能域分析和多序列比对发现,SiPPDK2蛋白与玉米、高粱和水稻PPDK蛋白的亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明,PEG、ABA、盐和低温胁迫对苗期SiPPDK2基因表达有不同程度的诱导。进一步研究表明,SiPPDK2基因在拔节期、抽穗期和灌浆期均参与了对干旱和光照的胁迫响应,其中抽穗期和灌浆期在干旱条件下及拔节期和灌浆期在弱光条件下其表达量显著上调。顺式元件分析结果表明,在SiPPDK2启动子区域主要包括激素类应答、逆境应答、光应答以及其他类生长调控相关的顺式元件。结果推测,SiPPDK2基因可能参与了谷子对非生物逆境胁迫的响应。     

辣椒4CL基因家族成员的鉴定与生物信息学分析

4-香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase, 4CL)基因家族调控植物木质素代谢、参与类黄酮和其他次生代谢产物合成。为了解辣椒Ca4CL基因家族的分子特性及生物学功能。本研究基于辣椒的全基因组测序结果鉴定4CL基因家族,并进行生物信息学分析。结果共鉴定获得8条辣椒4CL基因,不均匀的分布于基于3、7、11和12号染色体,其中Ca4CL06和Ca4CL08未锚定;辣椒Ca4CL的外显子数目在5～6之间,基序分析结果保守;分析顺式作用元件发现,在辣椒Ca4CLs上游2 000 bp序列中存在多个响应元件,包括光、Me-JA、厌氧诱导、低温等响应元件。辣椒4CL基因家族表达分析发现Ca4CL01在根、茎、叶、果皮(开花期后25 d,绿果期,转色期,转色10 d)、胎座(转色期,转色5 d,转色10 d)中均无表达,其余Ca4CLs表达具有较强组织特异性,Ca4CL04在叶、根、果皮等时期高表达。本研究为进一步分析Ca4CLs基因在生长发育、胁迫等条件下的功能和相应的信号转导途径提供了理论依据。     

铁皮石斛CIPK24与CBL1的互作及盐胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对盐胁迫的抗性机制,利用PCR技术从铁皮石斛cDNA中克隆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因CIPK24和类钙调素B亚基蛋白基因CBL1,用生物信息学技术对其编码蛋白的进化关系进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术分析它们的表达模式;并构建酵母表达载体,利用酵母双杂交技术研究这两个蛋白的互作关系。结果表明,铁皮石斛CIPK24和CBL1分别与拟南芥CIPK24以及CBL1蛋白的亲缘关系最近;空间表达模式分析发现CIPK24和CBL1基因在花萼、合蕊柱等生殖器官中表达量较高,而在营养器官中表达量较低;盐处理铁皮石斛组培苗后,CIPK24在根中受盐胁迫诱导上调表达,在茎和叶中表达量变化不明显;而CBL1基因在根和叶中受盐胁迫诱导均呈现上调表达,且根中CIPK24和CBL1基因的表达模式相似。酵母双杂交结果表明铁皮石斛CIPK24和CBL1蛋白能够互作。本研究表明,根中CIPK24和CBL1通过互作可能在铁皮石斛响应盐胁迫中起到重要作用,为进一步研究铁皮石斛耐盐性提供理论参考。     

水稻植物激素响应低温胁迫反应的转录组分析

植物激素在调节和控制植物生长发育、代谢过程、应对逆境等方面具有重要的作用。为明确水稻苗期植物激素对低温的应答机制,本研究以野生型粳稻品种‘中花11’为研究材料,经低温处理后,利用RNA-Seq技术分析植物激素调控水稻幼苗对低温胁迫的应答模式。通过转录组测序,共获得9.9×10~7条干净的序列,筛选出2 044个差异表达基因(DEGs)。首先,GO富集分析结果表明差异表达基因主要富集在生物学过程、细胞组分和分子功能三个方面。进一步的KEGG通路分析表明,差异表达基因主要富集在代谢途径、次生代谢生物合成、植物激素信号转导等途径。其中植物激素信号转导中低温应答的差异表达基因为31个,分别为25个上调表达基因和6个下调表达基因;主要参与了茉莉酸和脱落酸信号途径。这些研究结果对水稻苗期植物激素的低温应答机制完善和栽培调控具有重要的参考价值。     

过表达ZmCIPKHT基因增强植物耐热性

高温胁迫对植物正常生长发育及产量的影响越来越显著。为了适应外界环境的变化,植物进化出了一系列应对高温胁迫的分子遗传机制。类钙调磷酸酶B蛋白(CBL)互作蛋白激酶(CIPK),在ABA信号转导途径上积极参与植物对高温胁迫的响应。在前期全基因组关联分析的基础上,本实验克隆了一个与玉米耐高温性状相关的候选基因ZmCIPKHT, qRT-PCR结果表明ZmCIPKHT基因受高温胁迫的显著诱导。室内表型鉴定的实验发现过表达ZmCIPKHT的转基因拟南芥植株在高温胁迫下,比野生型的存活率显著提高,生长状态更好。玉米原生质体瞬时转化实验证明ZmCIPKHT蛋白定位于细胞核中。酵母双杂交实验验证了ZmCIPKHT蛋白与玉米CBLs家族中的ZmCBL4蛋白存在互作关系。同时, ZmCIPKHT转基因拟南芥在高温胁迫条件下,脱落酸(ABA)通路相关基因的表达水平有其相应的变化,揭示了ZmCIPKHT可能依赖于ABA信号转导通路来增强植物的耐热性。这些结果为解析玉米CBL-CIPK信号通路依赖于ABA途径对植物非生物胁迫响应的分子机制提供了新的实验根据。