广东紫珠ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选

为建立稳定性、重复性好的广东紫珠ISSR-PCR反应体系,以广东紫珠总DNA为试验材料,通过单因子结合正交试验对模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、引物浓度和Taq酶用量进行优化,确立了适用于广东紫珠的最佳ISSR-PCR反应体系：0.25 mmol/LdNTPs、1.00 U Taq DNA聚合酶、0.75μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg²⁺、100 ng模板DNA,总反应体积为25μL。同时建立重复性和稳定性均较好的ISSR-PCR扩增程序：预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火温度与每个引物相对应,退火45 s;72℃延伸90 s;34个循环;后72℃延伸10 min;4℃保存,扩增结束。用来自不同居群4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的20个引物。     

刺梨ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以刺梨为试材,对影响ISSR-PCR扩增结果的主要影响因素包括Mg2+,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模版DNA的浓度及引物退火温度进行了优化筛选.确立了适合刺梨ISSR-PCR分析的最佳反应体系,即20 μL反应体系中各组分浓度分别为:10×buffer2.0 μL,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,dNZPs0.1 mmol/L,引物2.μ mol/L,模板DNA20ng.PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性1 min,48℃退火温度45 s,72℃延伸1 min,34个循环,72℃后延伸6min.利用优化体系对3个刺梨品种进行体系稳定性检测,结果表明该优化体系的重复性和稳定性良好.     

正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系

以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。     

花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg~(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

红芪ISSR-PCR体系的建立及优化

通过单因素与中心复合设计相结合的方法建立优化红芪ISSR-PCR反应体系,并筛选引物,优化电泳时间及扩增循环数。建立的红芪ISSR-PCR反应体系为:25μL反应体系中10×PCR Buffer(Mg~(2+))3.5μL、模板DNA(30 ng/μL)2μL、PCR扩增引物2μL、Taq DNA聚合酶为1.25 U、d NTPs为2μL,dd H_2O 14.5μL,建立的扩增程序:94℃预变性5 min,开始34个循环;94℃变性30 s,后据不同退火温度的引物复性45 s,72℃延伸2 min,循环结束后72℃延伸7 min。本研究筛选出红芪扩增的引物17条;PCR反应产物电泳时间为120 min,最佳循环数为34,建立了稳定的体系,为进一步研究红芪的遗传多样性及遗传结构提供了帮助。     

巴戟天ISSR体系的建立与优化

以巴戟天叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于巴戟天的ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件,即20μl PCR反应体积中含0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,50 ng模板DNA.PCR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,53.4℃退火45 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.应用该ISSR体系对6份巴戟天种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

酥瓜(Cucumis melo var. conomon Group)ISSR-PCR反应体系建立与优化

利用正交设计L_(16)(4~5),对酥瓜ISSR-PCR反应体系的5个影响因素(引物,d NTPs,Taq DNA聚合酶,Mg2+和模板DNA)在4个水平上进行优化试验,并在36℃~56℃范围内摸索退火温度,建立适合酥瓜ISSR-PCR反应体系,结果表明,在20μL反应体系中,含有引物0.2μmol/L、d NTPs 0.3 mmol/L、Taq DNA聚合酶1.2 U、Mg2+1.0 mmol/L、DNA模板70 ng、10×Buffer 2.0μL为最佳反应体系,ISSR-PCR扩增程序中最佳退火温度为52.5℃。该体系为酥瓜种质资源的遗传多样性分析评价提供了帮助。     

毛竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg²⁺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA浓度及退火温度对毛竹ISSR-PCR扩增效果的影响。毛竹ISSR-PCR反应体系为:25μL的体系中含Mg²⁺1.5 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0 U,模板DNA 30 ng,10×Buffer2.5μL。扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,54℃退火60 s,72℃延伸1.5 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该体系稳定、可靠,可用于毛竹遗传多样性分析。     

金莲花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立金莲花ISSR-PCR最佳反应体系,本研究以内蒙古自治区境内野生金莲花为试验材料,采用L₁₆(4⁵)正交实验设计,对影响ISSR-PCR扩增结果的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、Mg²⁺、引物5个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化。结果显示,每个因素都具有极显著差异,影响最大的为dNTPs,其余依次为Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物,影响最小的为Mg²⁺浓度。最佳反应体系为:DNA模板30 ng,引物0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/20μL,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg²⁺1.0 mmol/L,反应总体积20μL。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸100 s,最后72℃延伸7 min,共38个循环,4℃保存。采用优化后的体系对金莲花不同居群进行验证,证明优化后体系扩增出明亮清晰的条带且重复性好,可用于后续金莲花遗传多样性分析。     

黑果枸杞ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为茄科枸杞属小灌木。果实为黑紫色球形浆果,具有较高的药用价值、营养价值、生态价值和经济价值。该研究以青海省野生黑果枸杞为材料,将对黑果枸杞ISSR-PCR反应产生主要影响的五种因子(Taq DNA聚合酶, dNTP, Mg~(2+),引物和模板DNA)进行L_(16)(4~5)的正交试验,以建立黑果枸杞ISSR-PCR最佳反应体系,并对反应体系进行验证。在此基础上筛选出适宜的ISSR引物,用梯度法优化各引物的最佳退火温度。结果表明:黑果枸杞20μL ISSR-PCR反应体系中包括Taq DNA聚合酶0.02 U/20μL,Mg~(2+) 1.65 mmol/L,dNTP 0.15 mmol/L,引物0.60μmol/L和模板DNA 50 ng;在100条ISSR引物中筛选出16条最适引物,并确定了各引物的最适退火温度为44℃～54.5℃;最佳扩增程序设定为94℃预变性5 min;然后94℃变性20 s,44℃～54.5℃复性1 min,72℃延伸1 min 20 s,共进行38个循环;最后72℃延伸6 min,4℃保存。该体系在黑果枸杞不同样品中所得条带清晰且多态性丰富,有助于后续青海省黑果枸杞种质资源筛选和遗传多样性分析研究。     

黄枝油杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

先运用正交设计进行初步筛选,再用单因素设计逐一优化对ISSR-PCR扩增效果有影响的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、模板DNA、循环次数及退火温度.建立了黄枝油杉的最佳反应体系和程序,即25μL体系中含2.0mmol/L的Mg2+、1.5U Taq DNA聚合酶、0.10mmol/L的dNTP、1.0μmol/L的引物、30ng的模板DNA以及2.5μL10×PCR buffer,其余的用灭菌的ddH2O补够25μL.扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～56℃(不同的引物,其退火温度不同,根据具体引物而定)退火45s,72℃延伸90s,以上3个步骤循环50次;最后72℃延伸7min;扩增产物放在4℃冰箱中保存.该体系和程序稳定性良好,结果可靠,可用于黄枝油杉遗传多样性分析.     

郁金香ISSR-PCR体系建立与优化

本研究以22个郁金香品种为材料,采用正交设计试验和单因素试验对ISSR-PCR反应中的5个影响因素:Mg~(2+)、d NTPs、Taq酶、引物、模板DNA进行4个水平的优化试验。结果表明最佳反应体系为:25μL体系中Mg~(2+)1.0 mmol/L、d NTPs 0.15 mmol/L、Taq酶0.25U、引物0.2μmol/L、模板DNA 100 ng。退火温度为58℃。该体系的建立有利于ISSR分子标记技术研究郁金香种质资源遗传多样性。     

辽东地区胡桃楸天然林ISSR分子标记体系的建立和优化

为建立胡桃楸天然林ISSR-PCR反应体系,本实验从DNA的提取到扩增进行了研究。通过对比CTAB和试剂盒两种方法,发现胡桃楸最佳DNA提取方法为试剂盒法。利用正交试验设计法确定了胡桃楸ISSR-PCR反应最佳体系,并对影响胡桃楸PCR反应的Taq酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度等因素进行了优化。最终获得胡桃揪ISSR-PCR反应的最优扩增程序为:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,48.3℃复性30 s,72℃延伸1 min,28次循环,最后72℃终延伸5 min。优化胡桃楸ISSR-PCR的最佳反应体系为:Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U/20μL、Mg~(2+)浓度为1.75 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L、引物浓度为0.35μmol/L、DNA模板浓度为150 ng/20μL。该研究为以后利用ISSR分子标记技术研究胡桃楸的亲缘关系和遗传多样性提供高效的技术手段。     

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。     

块根紫金牛ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立块根紫金牛ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即25 ul的体系中含Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP0.15 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,模板DNA50ng,10×Buffer 2.5μl.适宜的扩增程序是94℃预变性5 min,94℃变性30s,56.6℃退火45s,70℃延伸2.0 min;45个循环;72℃延伸7min,4℃保存.采用正交和单因素试验可快速建立ISSR-PCR反应体系.该体系稳定、可靠,可用于块根紫金牛遗传多样性分析.     

朱顶红SRAP-PCR反应体系的建立和优化

本研究采用L_(16)(4~5)正交试验设计方法,对朱顶红SRAP-PCR反应体系中的5种因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,引物浓度,DNA模板量和Taq DNA聚合酶用量)进行优化,结果表明各因素对朱顶红SRAP-PCR扩增反应影响大小依次为:d NTPs浓度引物浓度Mg~(2+)浓度DNA模板量Taq DNA聚合酶用量。优化获得的朱顶红最佳SRAP-PCR反应体系为:1×PCR Buffer、Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L、d NTPs浓度0.2 mmol/L、引物浓度0.25μmol/L、20μL体系中DNA模板量80 ng以及Taq DNA聚合酶用量0.5 U。用10个朱顶红品种基因组DNA对所得最优体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,能够为朱顶红遗传多样性研究和遗传图谱构建等提供重要技术支持。     

柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化

通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物.     

华北蓝盆花ISSR-PCR引物筛选及反应体系优化

本研究以内蒙古自治区境内8个自然居群野生华北蓝盆花叶片作为供试材料,进行基因组总DNA的提取检测、ISSR引物筛选和引物退火温度的筛选。针对华北蓝盆花ISSR-PCR反应中的模板DNA浓度和引物浓度2个影响因素,在4个水平上对华北蓝盆花ISSR-PCR反应体系进行优化,确定最佳反应水平,最终建立华北蓝盆花ISSR-PCR扩增的最佳反应体系。结果筛选出了8条多态性较好的华北蓝盆花ISSR引物及其退火温度,平均每条ISSR引物扩增出12.3条带,多态性条带占93.88%;华北蓝盆花ISSR-PCR反应的最佳体系为总体积20μL,DNA模板1μL,DNA模板浓度为60 ng/μL,引物0.6μL,引物浓度为0.8μmol/L,Ex Taq DNA聚合酶10μL,ddH_2O 8.4μL,扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性0.5 min,不同引物最佳退火温度下退火1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环;循环结束后72℃继续延伸7 min;4℃保存。本研究结果为进一步研究华北蓝盆花居群遗传多样性提供科学依据。     

枣树RAPD分析体系优化研究

利用随机引物扩增多态性(RAPD)分子标记技术研究不同枣树品系之间遗传多态性,建立起一个基于PCR技术的分子遗传标记RAPD分析的优化体系.设置不同的浓度梯度,从dNTPs、随机引物、Taq酶、Mg2 、缓冲液Buffe,的浓度及模板DNA的质量和用量方面考察,建立了枣树RAPD技术最优体系.结果表明:20μL反应体系组分含量为10×Taq酶Buffer 2μL,Mg2 浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物浓度0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度0.06 U/μL,DNA模板浓度1.5 ng/μL.最佳扩增程序为94℃预变性4 min,94℃变性30 s,36℃退火40 s,72℃延伸1min,50个循环,最后72℃延伸8 min.     

山羽藓ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用L16(45)正交试验设计法对山羽藓ISSR-PCR反应进行优化试验。研究结果表明,山羽藓ISSR-PCR最佳反应体系(25μL)为:Taq DNA聚合酶0.8 U,Mg2+1.5 mmol/L,d NTPs 0.4 mmol/L,引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,对该反应体系的影响顺序为:Taq DNA聚合酶引物d NTPs模板DNAMg2+。同时筛选出12条适合山羽藓的ISSR引物,并确定了每条引物的最适退火温度。所建立的体系稳定可靠,条带清晰且多态性丰富,可为后续开展山羽藓种植资源、遗传多样性及分子亲缘地理学研究奠定基础。