马铃薯块茎休眠解除过程中CAT酶活性变化及其编码基因的生物信息学分析

以马铃薯栽培品种"克新4号"为试验材料,测定了在马铃薯块茎休眠解除过程中H2O2含量、CAT活性和CAT基因的相对表达量,并对CAT基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明:马铃薯块茎中的H2O2含量和CAT活性变化与CAT1基因表达量变化的趋势相同,均在收获后第40 d达到最大值。马铃薯CAT1的CDS区长1 479 bp,编码492个氨基酸,是一种亲水性蛋白,有12个磷酸化位点,其与番茄CAT同源性高达99%。研究结果为阐明CAT在马铃薯块茎休眠解除过程中的作用提供了基础。     

马铃薯StNCED1基因过表达载体的构建及其遗传转化

马铃薯块茎的休眠和发芽对于块茎生产和加工极为重要,延长块茎休眠期有助于降低块茎水分和养分的消耗,从而提高其应用价值。本研究用PCR方法从马铃薯中克隆了9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)编码基因St NCED1,并构建了马铃薯块茎特异表达启动子CIPP驱动的St NCED1基因的植物过表达载体p BIC-St NCED1,然后通过根癌农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种"陇薯3号"获得转化植株,经卡那霉素抗性筛选得到5株抗性苗,PCR检测证明St NCED1基因已整合到马铃薯的基因组中。qRT-PCR检测表明St NCED1基因在转基因植株试管薯中的表达量分别比未转基因的对照增加2.10~8.09倍。该研究有助于培育块茎休眠期延长的马铃薯新种质。     

6-BA处理对马铃薯内源激素含量及StTCP15基因表达的影响

TCP基因家族是参与调控植物内源激素的重要转录因子,马铃薯中StTCP15基因受到细胞分裂素、ABA和GA3的诱导表达,并在块茎休眠打破过程中StTCP15基因表达量变化显著。为探究外源6-BA对马铃薯块茎休眠时间、内源激素含量变化及StTCP15基因表达模式的影响,以马铃薯栽培品种‘鄂薯10号’块茎为试验材料,用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分别测定了10 mg/L6-BA处理下马铃薯块茎内源GA3、ABA、6-BA、IAA的含量及StTCP15基因表达量变化。结果表明外源6-BA处理与对照相比提前1周打破块茎休眠,块茎内源激素含量短时间与对照差异显著,随着时间延长差异减小;在块茎休眠阶段随着贮藏时间的延长处理组与对照组块茎内源激素ABA、GA3和IAA含量升高,6-BA含量下降;休眠打破后ABA和IAA含量降低,GA3和6-BA含量升高;发芽期间4种内源激素含量均升高。RT-qPCR分析结果表明6-BA处理及对照块茎休眠期间StTCP15基因表达量持续升高,休眠解除后表达量下降。StTCP15基因可能参与ABA信号通路,并在马铃薯休眠...     

BR相关基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应分析

油菜素内酯(BR)是调控植物生长发育的重要激素。本项目组研究发现,BR合成和信号转导基因表达量均随马铃薯块茎休眠解除而升高,抑芽剂可明显抑制BR合成相关基因delta24-甾醇还原酶(DWF1)、甲基甾醇单加氧酶(SMO1)、信号转导成员油菜素内酯不敏感蛋白(BRI1)、信号转导激酶(BSK)和信号激活因子细胞周期蛋白(CYCD3)等在马铃薯块茎中的表达。还发现,低温可以显著延长马铃薯‘费乌瑞它’等品种的贮藏时间,而对‘米拉’等品种的作用不显著。为进一步探明BR合成、信号转导和激活基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应情况,本试验以休眠中后期的马铃薯‘费乌瑞它’和‘米拉’原原种为材料,采用常温(23±2)℃和低温(4℃)贮藏,利用q RT-PCR技术测定两个品种在萌芽过程中5个BR合成、信号转导及激活关键基因的表达量变化。结果表明,低温下,两个品种中的DWF1、BRI1基因在萌芽过程中的表达量保持在低水平;SMO1、BSK和CYCD3基因的表达量在‘费乌瑞它’的萌芽阶段维持在低水平,而在‘米拉’中的表达量却呈相对较高的水平。由此推测低温通过抑制SMO1、BSK和CYCD3基因在‘费乌瑞它’萌芽过程中的表达,抑制萌芽,而有效延长马铃薯贮藏时间。与低温显著延长该品种贮藏时间、延迟萌芽的效果一致。本研究为阐明马铃薯萌芽过程中BR调控机制及其与环境温度的关系,利用分子技术辅助选育耐贮藏品种,以及为马铃薯贮藏调控新技术研发提供新的依据。     

PVY引起马铃薯块茎细胞坏死的相关基因研究

本研究采集健康马铃薯块茎和被PVY侵染的马铃薯块茎为材料,选取马铃薯RCCR基因和LSD1基因为目标基因。首先提取总RNA后通过反转录PCR(RT-PCR)、琼脂糖凝胶电泳,证明RCCR基因和LSD1基因成功获得,然后进行荧光定量PCR(qPCR)测定在PVY侵染的马铃薯块茎中RCCR基因和LSD1基因的相对表达量,最后又进行了目标基因编码蛋白的结构分析。结果表明,这2个基因的相对表达量均有所下降,推测这2个基因与马铃薯块茎细胞坏死相关,为之后研究PVY引起马铃薯块茎细胞坏死的相关分子机制做了前期探索,为今后的分子育种和抗病药物筛选提供了可选的靶点。     

油菜素内酯合成和信号转导基因在马铃薯块茎贮藏期间的表达变化及对萌芽的影响

为探明油菜素内酯BR在块茎萌芽中的作用,建立更有效的种薯催芽调控体系,选择了休眠期不同的3个品种,利用q RT-PCR分析与BR合成、信号转导、调控有关的9个基因在贮藏期间及抑芽处理下的表达模式;同时检测BR类似物24-表油菜素内酯(24-e BL)及其与赤霉素GA3对块茎萌芽的影响。结果表明,涉及BR合成的4个基因表达量均随贮藏时间延长升高,短休眠品种升高的时间点早于中、长休眠品种;信号转导及调控基因中BRI1和CYCD3的变化与合成基因相似,BSK和TCH4的表达量则在中、长休眠期品种中保持恒定。抑芽处理在贮藏前期能刺激这些基因的表达升高,但之后都迅速下降并保持低水平。转录因子BZR1在各品种中以及抑芽处理下均没有明显变化。24-e BL利于块茎解除休眠,但不促进芽的伸长生长,与GA3互配效果更佳,单株块茎增重37.92%~98.41%。结论表明,BR合成和信号转导是块茎从休眠向萌芽转变的必经生理过程,它与GA3互配用于催芽更利于种薯萌芽的整齐、健壮并促进块茎形成。     

马铃薯StCYP85A3促进萌芽及根系伸长的功能解析

油菜素内酯(BR)是一类植物甾醇类激素,对植物生长发育及胁迫应答具有显著的调控作用,马铃薯中StCYP85A3作为BR合成酶的编码基因,功能仍待进一步探究。本研究从‘川芋10号’马铃薯中克隆出该基因,生物信息学分析表明该蛋白具有催化BR合成的典型亲氧结合域,属于CYP85As家族成员。通过组织表达分析发现该基因在块茎芽眼及根中表达量最高,且芽眼中的表达量随着储藏时间的延长而增加,在块茎芽眼休眠解除时表达迅速升高。同时发现外源BR可诱导马铃薯芽眼及根中StCYP85A3表达量升高,从而显著促进了种薯萌芽及幼苗根的伸长。通过在拟南芥野生型及cyp85a2突变体中过表达StCYP85A3发现,过表达株系种子萌发及根系伸长都早于野生型,同时回补株系弥补了突变体种子萌发、植株根系生长迟缓的缺陷。此外,外源BR对过表达株系种子萌发、根系伸长无显著促进作用,但显著促进了野生型、突变体及回补株系种子萌发、根系伸长。上述马铃薯及拟南芥试验结果表明, StCYP85A3具有促进萌芽及根系伸长的功能。     

马铃薯野生种CHS基因cDNA的克隆与表达分析

设计简并引物,用RT-PCR法从马铃薯野生种(Solanum pinnatisectum)克隆到了CHS(Chalcone synthase,查尔酮合酶)基因的全长cDNA,并用半定量RT-PCR法进行了表达分析.序列分析表明,CHS基因编码一个389个氨基酸残基的多肽,在氨基酸水平上与其他茄科植物的同源性达到89%～93%,多重比较和系统发育分析均表明该基因为CHS家族中的一个新成员;检测了CHS基因的空间表达模式,该基因在花和匍匐茎中表达量最高,在根和块茎中没有检测到,这与花和匍匐茎呈淡紫色有花色苷合成,而根和块茎呈白色无花色苷合成是相一致的;发现在块茎中CHS受光诱导表达,光照后的第3天表达量最高,而在光照前检测不到,光照前块茎为白色,随着光照时间的延长,其表层颜色因积累花色苷而变成紫红色.     

金柑开花关键基因FcFT1的克隆及表达分析

本研究以融安金柑为试材,采用同源克隆技术获得成花素基因Fc FT1全长序列,并对该基因的生物信息学和遗传进化关系进行了分析。利用q RT-PCR技术,分析了Fc FT1在花发育期间不同花器官、不同组织,以及日周期中Fc FT1在花、茎、叶的表达情况。结果表明:Fc FT1基因完整开放阅读框为531 bp,编码177个氨基酸。Fc FT1编码的蛋白具有单一而非常保守的PEBP结构域;蛋白质结构比较不稳定,为亲水蛋白。系统进化树表明Fc FT1与甜橙、温州蜜柑和枳壳中的FT同源基因亲缘关系最近。q RT-PCR结果显示,在花发育期,花药中Fc FT1表达量最高;日周期变化中,Fc FT1在花、茎、叶中的平均表达量差距不显著,表达较稳定。本研究结果为进一步揭示FT基因在金柑开花调控中的功能奠定了基础。     

转PPase基因对马铃薯块茎休眠相关生理特性的影响

马铃薯块茎的休眠和发芽对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和加工等具有十分重要的意义。本研究以25℃室温条件下贮藏90d后的转正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯Favorita的块茎为材料,对贮藏块茎的PPase活性和及Pi、可溶性糖、淀粉、蛋白质含量进行了测定,以探讨PPase基因对马铃薯相关休眠生理特性的影响。结果表明,与对照相比,转正义PPase基因的两个株系F-2-1和F-2-4块茎中的PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量增加、淀粉含量和蛋白质含量降低,且与对照相比均达到极显著水平(只有F-2-4淀粉含量与对照相比无显著性变化);转反义PPase基因的两个株系F-1-1和F-1-2块茎中PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量降低、淀粉含量增加,与对照相比均达到极显著性水平,而蛋白质含量与对照相比无显著性变化。     

天女木兰MsAHG1和MsAHG3基因的克隆及表达分析

为了探究ABA信号通路中蛋白磷酸酶PP2C调控天女木兰种子休眠解除的分子机制,本研究以天女木兰种子转录组数据为参考,克隆获得了A类PP2C的2个基因(MsAHG1和MsAHG3)。生物信息学分析结果表明,MsAHG1、MsAHG3基因全长分别为1 269、1 209 bp,编码422、402个氨基酸,均属于PP2C家族;所编码的蛋白质相对分子量分别为44.885 43、43.356 03 kD,均属于不稳定的亲水蛋白;所编码氨基酸的同源性与系统进化分析显示,天女木兰的AHG1、AHG3蛋白分别与沉水樟的AHG1、AHG3蛋白亲缘关系较近。通过实时荧光定量PCR探究MsAHG1、MsAHG3基因在天女木兰不同组织、种子休眠解除过程及吸胀过程的相对表达量,发现MsAHG1和MsAHG3基因在干种子中表达量最高,且MsAHG3基因表达量极显著高于MsAHG1基因;MsAHG3基因在种子休眠解除和吸胀过程中的表达量均高于MsAHG1基因,表明MsAHG3基因在天女木兰种子休眠解除中发挥关键作用。     

彩色马铃薯二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的克隆及生物信息学分析

花色素苷是影响花色的主要色素,二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因是花色素苷合成的关键酶基因.本研究以云南地方彩色马铃薯品种‘剑川红’和‘转心乌’,外引品种‘黑美人’为实验材料,通过RT-PCR方法从其块茎表皮中克隆到DFR基因的完整cDNA序列,并进行了生物信息学分析.分析结果显示供试的三个彩色马铃薯的DFR基因编码3...     

基于转录组测序分析的黄精种子休眠解除相关差异基因研究

旨在获得黄精转录组数据库并挖掘参与其种子发育和休眠解除相关基因,以休眠解除前后的黄精种胚为试材,利用新一代高通量测序手段对供试样品进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析。黄精种子休眠解除前后样品中共得到79716个差异表达基因,上调的表达基因有60074个,下调的表达基因有19642个。休眠解除前后的黄精种胚中共有130284个差异表达基因被GO功能注释到生物进程、分子功能和细胞组分3个大类56个亚类,注释的差异表达基因与代谢过程、生物调控、细胞组分合成和酶催化活性等密切相关。KEGG代谢通路结果表明,共有65038个差异表达基因,涉及138个代谢通路,主要参与碳代谢、次生代谢产物的生物合成和多糖的代谢。基于KEGG数据库中注释结果,共发现15条与黄精种胚休眠解除相关的代谢通路。黄精种子发育与休眠解除过程,大量的种胚形态建成、多糖分解及蛋白质合成差异基因参与表达,并涉及到多个代谢途径的相互作用,构成复杂的休眠解除调控网络。     

马铃薯无机焦磷酸酶基因cDNA在大肠杆菌中的表达及蛋白质特征分析

通过调节蔗糖代谢途径中的协同因子无机焦磷酸（PPi）可以调控马铃薯块茎的休眠和发芽特性。本研究将马铃薯无机焦磷酸酶（PPase）基因（Gen Bank Accession No：EF091820）与载体pET-28a融合,构建了原核表达载体pET—PPA,然后导入大肠杆菌BL21（DE3）中,经SDS-PAGE分析表明PPase基因在大肠杆菌中能够表达。用生物学软件对PPase基因及其编码的蛋白质分析表明,该PPase基因与与茄属的同源性高达89％-97％,与其他物种PPase基因的同源性在77％-80％之间;系统进化树分析表明PPase与茄科茄属和藜科甜菜属的进化类群最接近;其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点,没有跨膜区;蛋白质二级结构预测显示,有63个氨基酸可能形成α-螺旋结构,38个氨基酸可形成延长链;通过亚细胞定位可知,它主要是一种细胞质和线粒体基质蛋白。     

马铃薯晚疫病抗性相关基因StDIR1的克隆与表达

马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein 1相似性高达76%,同一性为62%。利用半定量RT-PCR技术分析发现,致病疫霉、H2O2以及NO可以诱导该基因不同程度的上调表达。组织特异性分析表明,该基因在马铃薯根组织中表达量最高,而在茎、叶、花以及块茎组织中的表达量偏低。首次表明StDIR1基因与马铃薯对致病疫霉的侵染应答具有相关性。     

天女木兰MsGID1同源基因的克隆及表达分析

为了探究天女木兰种子休眠解除的分子机制,本研究以Illumina高通量测序获得的天女木兰转录组数据为参考,从赤霉素信号途径起始受体基因(GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1, GID1)入手,克隆获得2个同源基因(MsGID1b和Ms GID1c)。在此基础上,对天女木兰2个GID1同源基因进行生物信息学分析:MsGID1b和MsGID1c全长分别为996 bp和1 032 bp,二者分别编码331和334个氨基酸;所编码的蛋白质相对分子量分别为37.021 kD和38.363 kD;2个GID1同源基因均是不稳的亲水性蛋白且无信号肽;Ms-%GID1b和MsGID1c属于α/β折叠水解酶超家族。通过实时荧光定量PCR探究MsGID1b和Ms GID1c在不同温度对种子吸胀过程表达模式的影响,发现4℃处理基因表达量最高,其中Ms GID1c的相对表达量显著高于MsGID1b,表明其在种子解除休眠中起关键作用。     

马铃薯StKNOX1基因的克隆及表达分析

KNOX基因是一类转录调控因子,其和植物的生长发育密切相关。为了探讨同源异型盒(KNOX)基因在马铃薯(Solanum tuberosum L.)块茎发育中的作用,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了1个KNOX同源基因,且根据属性情况命名为StKNOX1,其属于KNOX家族I类蛋白,编码含344个氨基酸的蛋白,包含KNOX1、KNOX2、ELK等结构域。根据相关生物信息研究结果,该基因编码的蛋白与番茄中KNOX1的一致性最高(93.7%)。StKNOX1基因在马铃薯的各组织器官中均有表达,在根和块茎中的表达水平显著高于其他部位的表达水平。本研究将为进一步开展基因功能研究奠定理论基础,为马铃薯生物技术育种提供基因资源。     

马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

GBSSI是马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶, 为培育高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料, 根据GenBank登录号X58453设计特异引物, 采用RT-PCR技术获得马铃薯块茎GBSSI相似基因, 利用生物信息学相关软件分析, 预测GBSSI相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能。结果表明, 克隆的GBSSI相似基因与报道的GBSSI基因序列相似性达到99.78%, 其开放阅读框长1 824 bp, 编码607个氨基酸, 具有许多重要功能位点;三级结构预测结果表明该蛋白具有淀粉合成功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为EU403426。以此基因CDS内542 bp的靶标序列作为干扰区段, 扩增GBSSI的正反向基因片段, 并引入237 bp的内含子序列, 构建由Patatin启动子驱动的具有“正义基因片段gbss A-内含子VP1-ABI3-like protein-反义基因片段gbss B”的植物干扰表达载体pBI121g-PgABI, 将为淀粉合成的进一步研究和高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的马铃薯品种的培育奠定基础。     

马铃薯光敏色素作用因子基因PIF4的克隆及表达分析

本研究以栽培种马铃薯青薯9号为试验材料,利用同源克隆技术分离出一个光敏色素作用因子St PIF4基因,该基因开放阅读框长度为1 554 bp,编码517个氨基酸,含有HLH保守结构域;系统进化树分析表明,StPIF4与茄科植物聚为一类,和已测序的马铃薯DM亲缘关系最近。蛋白功能预测表明,StPIF4蛋白不具备信号肽位点和跨膜结构,其蛋白序列含有56个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞核或细胞质中。RT-qPCR分析表明,StPIF4在根、茎、叶片、块茎和匍匐茎中均能表达,在叶片中相对表达量最高,根中较低。通过对StPIF4基因的克隆和表达分析,为深入马铃薯StPIF4的功能分析提供科学基础。     

牡丹PsELF1基因的克隆及表达分析

本研究以已获得的早花基因的EST序列为模板设计引物,通过RACE技术扩增全长,使用生物学软件和q RT-PCR技术分别进行生物信息学分析和表达模式分析,获得牡丹早花基因Ps ELF1的全长及其表达模式,为后续研究其功能提供条件。结果显示,扩增得到7 107 bp的Ps ELF1全长cDNA,其中,包括3'UTR485 bp,5'UTR 464 bp和6 258 bp的编码区,共编码2 085个氨基酸,分子量为238.43 kD。Ps ELF1包括4个可能的磷酸化位点,且均位于N端。二级结构预测显示,Ps ELF1含α-螺旋和无规卷曲较多。同源性分析结果表明,Ps ELF1与杨树ELF1同源性最高。表达特性分析表明,Ps ELF1在花芽休眠解除过程中Ps ELF1的表达水平在0～14 d下调,在14～21 d上调,然后在21～28 d下调。而在低温21 d移入温室后的开花过程中呈下调模式。本研究结果对培育牡丹早花或晚花品种、延长牡丹的观赏期、提高牡丹观赏质量和经济价值具有重要意义。