橡胶树品种‘湛试327-13’乙烯响应分子机制分析

橡胶树‘湛试327-13’新品种兼具抗寒和高产的特性,揭示其在乙烯刺激后的分子机制有利于精准鉴定和选育种质资源。本研究以1.5%乙烯利处理橡胶树‘湛试327-13’开割树为材料,利用荧光定量技术分析胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白和橡胶生物合成关键酶等基因的表达规律,结果表明：乙烯利处理并连续割6刀后,橡胶树活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因在树皮表达量高于其在胶乳中表达量。与对照相比,随着割胶刀数的增加,‘湛试327-13’树皮脂肪氧化酶(HbLOX1)和过氧化物酶基因(HbPOD1)基因表达显著上调,最高为22.15和31.95倍;蔗糖转运蛋白HbSUT1、HbSUT2a分别提高66.11和58.50倍;几丁质酶(HbCHI)、葡聚糖酶(HbGLU)和橡胶素(HbHEV)分别提高16.93、8.09和10.37倍;橡胶生物合成关键酶基因HbGGPPS和HbHMGS1分别提高了14.71和15.05倍。说明乙烯刺激橡胶树后,‘湛试327-13’胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因依次高表达且持续时间长达6刀(18 d...     

不同品系橡胶树的组份及生胶性能研究

为了利于天然橡胶研发利用,利于橡胶制品选材,顺应可持续发展战略,提高天然橡胶制品经济效益,笔者研究了RRIM600、热研7-20-59、热研8813、热研7-33-97、PR107和热研8-79这6种橡胶树品系的天然橡胶鲜胶乳性能、生胶性能和混炼胶的硫化特性以及硫化胶的物理机械性能。结果表明：不同品系天然胶乳的化学成份、生胶性能存在差异;热研8-79的干胶含量最高,杂质含量最高;热研7-20-59的灰分含量、丙酮溶物含量最高;热研8-79和热研7-33-97的硫化胶所需的正硫化时间最长,而热研88-13所需的正硫化时间最短;RRIM600物理机械性能最好。     

树干乙烯利处理对橡胶树叶片蔗糖代谢的影响

为增加天然橡胶产量,乙烯利被广泛使用。乙烯利刺激橡胶树能通过延长排胶时间,促进水孔蛋白的表达,增加蔗糖向乳管中转运等机制促进橡胶树树干中胶乳的生物合成。然而,乙烯利刺激树干,是否会对叶片造成影响,影响胶乳的合成,目前仍不清楚。本研究以热研8-79和热研72059一年生芽接苗为实验材料,用浓度为0%、0.6%和1.1%的乙烯利处理树干,检测叶片生理指标的变化。实验结果表明:热研8-79施用乙烯利后,胶乳产量增加,同时,叶片中叶绿素含量降低,蔗糖含量也显著降低,而果糖和葡萄糖含量升高,蔗糖合成酶活性上升,液泡转化酶和蔗糖分解合成酶活性增高。热研72059与热研8-79的结果类似,但蔗糖磷酸活性酶显著性升高,且蔗糖含量,蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性远高于热研8-79品种。研究结果表明,乙烯利刺激树干后,能改变叶片中蔗糖的代谢活动,这可能也是增加胶乳产量的机制之一。本研究以叶片为研究对象,为从源-库关系解析乙烯利刺激促进天然橡胶合成机制提供技术理论基础。     

橡胶树一个胶乳高表达MDR型ABC转运蛋白的克隆与表达研究

ABC转运蛋白（ATP-Binding Cassette）是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族之一,与植物次生代谢物的排泌、积累及跨膜运转密切相关。本研究筛选已构建的乙烯刺激橡胶树胶乳消减文库,克隆了1个ABC转运蛋白基因EST,通过RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因开放阅读框（ORF）共3753 bp,编码1251个氨基酸残基。研究表明其在橡胶树基因组中存在多个拷贝,主要在胶乳中表达,且在乙烯或茉莉酸刺激（刺激产胶）条件下上调表达。推测其可能与橡胶生物合成过程中的物质运输密切相关。     

核黄素对橡胶树(Hevea brasiliensis)7-33-97悬浮细胞防卫反应的激活作用

本研究以橡胶树7-33-97悬浮细胞为材料,用核黄素进行诱导处理,并初步探索了其诱导机制。结果表明,核黄素处理橡胶树7-33-97悬浮细胞后,产生了活性氧迸发,该变化可以被钙离子通道抑制剂LaCl_3抑制;核黄素诱导橡胶树7-33-97悬浮细胞胞外基质碱性化,该变化能被蛋白激酶抑制剂K252a部分抑制,表明蛋白质磷酸化参与了该抗病过程的传导;苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)的活性被诱导而明显升高;核黄素诱导了防卫相关基因HbPR-1和HbNPR1的表达。说明核黄素能够诱导橡胶树7-33-97悬浮细胞产生抗病防卫反应,该抗病信号传导途径可能是通过水杨酸信号通路进行的。     

巴西橡胶树HbRPB11基因的克隆与表达分析

橡胶树树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。生产上施用乙烯利通过延长橡胶树割胶后的排胶持续时间,调节胶乳代谢,从而达到增产的目的。但目前对于转录复合体关键成员RNA聚合酶Ⅱ在胶乳代谢过程中的动态变化尚不清楚。本研究采用RACE和RT-PCR方法,从橡胶树无性系CATAS7-33-97的胶乳中克隆到编码RNA聚合酶Ⅱ关键亚基RPB11的同源基因,命名为HbRPB11。该基因全长659 bp,包含351 bp的开放阅读框,编码一个由116个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为13.53 k D,理论等电点为5.934。实时荧光定量PCR结果表明,HbRPB11在橡胶树的多个组织中均有表达,其中在成熟叶片和胶乳中的表达量最高,并且受割胶和乙烯利处理显著上调。橡胶树不同种质间的表达模式分析显示HbRPB11基因在橡胶合成效率高的种质中的表达量要显著高于橡胶合成效率低的种质,表明该基因的表达量与橡胶合成效率呈正相关性,有可能作为生产上筛选高效合成橡胶种质材料的分子标记。     

大薯PR1基因在炭疽菌、激素处理下的表达分析

炭疽病是大薯种植过程中所遭受的最严重病害。为了探究PR1基因家族对炭疽菌的响应情况,本研究在前期转录组的基础上筛选了6个PR1基因,设置5组处理;炭疽菌处理、MeJA处理、SA处理、MeJA+炭疽菌处理、SA+炭疽菌处理,分别在处理1 d、2 d、3 d、4 d、5 d采用荧光定量PCR进行6个基因表达量差异分析。结果显示6个不同PR1基因在炭疽菌处理下都会使得其表达量增高,炭疽菌诱导下PR1-1基因5 d时表达量为6个基因中最高,达到峰值。炭疽菌+MeJA诱导下PR1-6表达量较高,4 d时达到峰值。炭疽菌+SA诱导下PR1-9在4 d表达量达到峰值。Me JA诱下PR1-6基因表达量较高,2 d时达到峰值。SA诱导下PR1-1基因2 d时表达量达到峰值,于6个基因中最高。由此可见,不同PR1基因对炭疽菌以及不同激素处理响应不同。     

13份橡胶树新种质对已烯利刺激割制的生理反应

我国橡胶树新种质创新利用进展缓慢,为了深入全面的鉴定橡胶树新种质,加速其利用进程,笔者以RRIM600为对照,采用常规割和乙烯利刺激割制,对我国1986年定植于大田鉴定评价圃的13份橡胶树新种质的干胶含量、干胶产量、排胶初速度、堵塞指数、胶乳硫醇、无机磷、蔗糖及镁离子含量等生理参数进行了测定分析。结果表明：单从胶乳生理特性而言,并不能从参试种质材料中筛选出特别优良的种质供生产中直接利用,且乙烯利刺激割制下参试材料株次干胶产量均不及对照品种,但9、13号种质在乙烯利刺激割制下表现出了较好的胶乳生理状况,显示出了良好的产胶潜力。     

巴西橡胶树RALF基因家族的鉴定及其表达分析

快速碱化因子(rapid alkalinization factors, RALFs)是一种植物多肽类激素,参与胞内MAPK信号传递、细胞伸长调控、花器官发育及免疫应答等植物重要生理过程。本研究利用生物信息学方法对橡胶树RALF基因家族进行全基因组鉴定,对其序列特性、基因结构、保守基序、系统进化及表达特性进行系统研究。通过同源比对在橡胶树基因组中共鉴定到16个RALF基因,分别命名为HbRALF1～HbRALF16。序列分析结果表明,这些基因编码氨基酸数目介于108～149 aa之间,分子量和等电点分别介于11.92～16.88 kD和5.41～9.33。多序列比对结果表明,HbRALFs含有S1P蛋白酶识别位点、受体蛋白识别位点YISY保守序列和四个保守半胱氨酸。基于转录组数据的组织和乙烯刺激表达特性分析显示,16个橡胶树RALF基因至少在一个组织中表达,8个胶乳中高表达的RALF还参与乙烯刺激响应。本研究为进一步研究RALF基因家族在橡胶树关键农艺性状调控中的作用提供参考依据。     

巴西橡胶树逆境相关HbCPK1结构与功能分析

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPK,CPK)在植物对生物和非生物胁迫抗性中具有重要作用。为揭示橡胶树CPK家族成员在橡胶树白粉病抗性中的作用,从巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片中克隆了一个CPK基因,其推导氨基酸含有特征性蛋白激酶家族结构域和4个EF手型蛋白结构域,命名为HbCPK1。该基因在花、叶片、胶乳和树皮中均有表达,在花中表达量最高。干旱、机械伤害和白粉病浸染均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。表明HbCPK1主要受非生物胁迫反应诱导,参与橡胶树对逆境响应,本研究为阐明HbCPK1基因在橡胶逆境胁迫响应下的作用提供理论参考。     

巴西橡胶树水解酶基因克隆与表达分析

磷是植物生长发育所需的大量重要元素,而缺磷是提高橡胶产量的重要限制因子,研究橡胶树耐低磷胁迫的分子机制,对提高橡胶树磷养分的利用效率具有重要意义。利用低磷胁迫差减文库获得的EST,通过RT-PCR和RACE技术克隆橡胶树应答低磷胁迫基因,并利用实时荧光定量PCR技术进行表达分析。结果表明,从橡胶树中克隆到1个应答低磷胁迫的水解酶基因Hbhyd,全长1860 bp,包含1个1479 bp的完整阅读编码框(ORF),编码56.1 kD(492aa)蛋白,经NCBI同源性分析,HbHyd编码的氨基酸序列与蓖麻水解酶的氨基酸序列一致性为84%。利用荧光定量PCR分析Hbhyd的表达水平,可知在低磷磷胁迫处理下,HbHyd在橡胶树根中表达量明显上调。Hbhyd基因在橡胶树应答低磷胁迫过程中上调表达,该基因的克隆有助于提高橡胶树磷素吸收利用效率。     

巴西橡胶树HbMADS5的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,通过PCR克隆了1个编码巴西橡胶树MADS-box转录因子的基因,命名为Hb MADS5。Hb MADS5全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测Hb MADS5蛋白分子量为40.75 k D,等电点为6.38。氨基酸序列比对分析表明,Hb MADS5具有MADS-box家族典型的MADS-box保守结构域,与蓖麻、葡萄、麻风树、甜橙、木本棉、蒺藜状苜蓿等物种的MADS-box家族成员具有较高的同源性,分别为79%、74%、72%、70%、65%和59%。Hb MADS5与麻风树中的1个MADS-box成员亲缘关系最近。Hb MADS5在巴西橡胶树根、茎、叶、花和胶乳等中都有表达,其中在胶乳中表达量最高,在根中表达量最低;茉莉酸甲酯和乙烯能诱导Hb MADS5的表达,茉莉酸甲酯处理12 h后Hb MADS5表达量提高了10倍,乙烯处理48 h后Hb MADS5表达量提高了2倍。本研究将为进一步研究Hb MADS5在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树雄性不育相关基因HbACO1的表达与生物信息学分析

ACO1 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase 1)是植物内源乙烯生物合成途径的限速酶,与花芽分化和器官衰老密切相关。本研究通过实时荧光定量技术对基因HbACO1在雌雄花、叶、胶乳和嫩皮组织的表达模式进行分析,结果显示基因HbACO1在雄花表达量最高,在雌花、叶和嫩皮中表达量低,在胶乳中几乎不表达。对雄花发育不同时期(小孢子母细胞时期,四分体期和单核小孢子时期)的HbACO1基因表达量分析表明：在不育品种(‘热研7-33-97’,‘PR107’)的四分体和小孢子时期表达量明显高于在可育品种(‘热研93-114’,‘天任31-45’)相应时期的表达量,推测基因HbACO1可能在雄花的四分体及单核孢子期间异常高表达导致了雄花败育现象。利用mRNA原位杂交技术对HbACO1基因进行了原位表达分析,结果显示在不育品种中绒毡层细胞、花药外壁细胞和小孢子母细胞能检测出基因HbACO1的荧光信号,在可育品种中在花柱和花药外壁有荧光信号,推测HbACO1基因可能主要是在雄花的绒毡层、花药外壁和小孢子母细胞特定细胞类型中表达来调控雄花的发育,而在这些细胞类...     

桃肉质及粘离核性状形成及其相关基因的表达分析

以大久保、08-9-106和08-9-107为试材,分析了果实成熟后期中果皮果肉硬度变化、粘离核性状的形成以及中果皮和近核处果肉的乙烯释放和相关基因表达的变化。结果表明,在果实中果皮中,大久保在成熟期果肉硬度下降快,乙烯释放明显,同期PpPG、PpACS1、PpYUC11相对表达量呈先升后降趋势;而08-9-106果肉硬度下降较快,但没有明显的乙烯释放和乙烯合成相关基因(PpACS1和PpYUC11)的表达;08-9-107在成熟后期硬度下降不明显,没有检测到明显的乙烯释放和乙烯合成相关基因的表达。在近核处果肉中,大久保的果实表现为离核性状,同期检测到明显的乙烯释放和相关合成基因(主要为PpACS1)的表达;而08-9-106的果实也表现为离核,但乙烯释放和基因表达与中果皮类似,均无明显检出;08-9-107表现为粘核,虽然乙烯释放量和PpACS1表达较低,但PpACO1和PpYUC11却有一定程度的表达。综上,大久保属于响应乙烯的离核溶质类型,08-9-106属于不响应乙烯的离核溶质类型,08-9-107属于响应乙烯的粘核硬质类型。桃果肉硬度的变化及粘离核性状的形成与PpPG基因的表达相关,PpACS1而非PpACO1是3份桃种质中调控乙烯含量的关键基因。     

巴西橡胶树HbNAC55的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,利用q RT-PCR技术,从巴西橡胶树中克隆得到1个NAC转录因子基因,命名为Hb NAC55。Hb NAC55全长1 755 bp,该基因编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65.06 ku,等电点为4.79。蛋白结构分析发现,该蛋白含有一个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与木薯、胡杨、可可、土瓶草、梅、胡桃、甜橙等物种的NAC家族成员具有较高的同源性,分别为81%、61%、56%、57%、55%和53%。通过q RT-PCR发现Hb NAC55在橡胶树胶乳中表达量最高。茉莉酸和乙烯均能诱导胶乳中Hb NAC55表达上调,其中茉莉酸甲酯处理12 h后Hb NAC55表达量提高了近6倍,乙烯处理48 h后HNAC55表达量提高了近1.7倍。本研究将为进一步研究Hb NAC55在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树HbACO16基因的克隆与功能分析

天然橡胶是一种战略性工业原料,中国消费的天然橡胶严重依赖进口。外源乙烯刺激可以激活橡胶树树皮乙烯的合成并提高橡胶树胶乳产量,但是其分子机制仍不清楚。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)是植物体内乙烯生物合成途径中的关键酶,本研究从橡胶树树皮中克隆了预测的HbACO16的编码序列,通过生物信息学对其理化性质进行初步分析,该基因编码362个氨基酸,等电点为6.04,预测蛋白大小为48 kD。为了进一步验证其体外酶活性,在大肠杆菌中表达了HbACO16的重组蛋白,结果表明HbACO16重组蛋白不具有ACO酶活性。本研究为解析橡胶树内源乙烯合成中关键蛋白ACO的生理功能提供了参考。     

巴西橡胶树地上部地下部均一化酵母双杂交cDNA文库构建及评价

缺磷是影响橡胶树产量的主要因素之一,蛋白泛素化在其中发挥了重要作用。为研究泛素化在橡胶树低磷胁迫中的调控作用,本研究分别以巴西橡胶树"热研7-33-97"组培苗地上部和地下部为材料,构建酵母双杂交文库,并对其进行了评价。首先用CTAB法大量提取橡胶树地上部和地下部总RNA,再用PROMEGA试剂盒处理获得纯化的m RNA,然后采用SMART誖技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds-cDNA),继而通过双链特异性核酸酶(DSN)对ds-cDNA进行均一化处理,再经CHROMA SPIN+TE-400柱子纯化长片段的cDNA,最后将获得的长片段cDNA和线性化载体p GADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞,构建均一化酵母双杂交文库。结果显示:地上部文库滴度8×107cfu/m L,插入片段≥0.5 kb的重组率为100%;地下部文库滴度7×107cfu/m L,插入片段≥0.5 kb的重组率为87%。该结果表明文库已成功构建,可以用于进一步实验。     

橡胶树生殖发育相关基因的RNA-Seq转录组分析

为了揭示橡胶树生殖发育相关基因的表达变化情况,本研究以橡胶树热研7-33-97花序、雄蕊、雌蕊为试验材料,利用Illumina HiSeq~(TM) 2000对早期发育的花序、雄蕊及雌蕊进行RNA-Seq测序,共识别出30 164个长度大于200 bp的Unigenes,与其它物种的序列相似性进行比较,发现所得Unigenes与麻疯树的Unigenes相似数量最多。进一步对测序所得Unigenes进行GO(Gene ontology)功能注释和Pathway显著性富集分析发现这些Unigenes能够编码相应的993种酶(Enzyme,EC),参与了197条生物学通路(pathway),相关Unigenes主要涉及碳水化合物运输与代谢、膜转运代谢以及能量代谢通路,由此推测碳水化合物合成与运输相关基因可能在橡胶树生殖发育过程中起重要调控作用。本研究通过对橡胶树花器官发育相关基因进行转录水平分析,为深入开展橡胶树生殖发育相关功能基因的克隆和功能验证提供了丰富的基因资源,并为揭示橡胶树生殖发育的分子调控机制奠定良好基础。     

碳水化合物代谢参与番茄响应低磷胁迫的分子机制

磷是植物生长发育所必需的大量营养元素。土壤中磷主要是以植物不能吸收利用的固定态和有机态存在,所以低磷胁迫是其生长发育过程中常见的一种逆境胁迫。为明确不同基因型番茄通过碳水化合物代谢的改变从而启动根部对低磷的响应机制,本研究对两个番茄品系9号(耐低磷型)和30号(磷敏感型)进行低磷胁迫处理,测定了不同部位碳水化合物含量及关键酶活性的变化,并利用实时定量RT-PCR技术分析了蔗糖转运蛋白SUT在番茄不同部位中的表达。结果表明,番茄品系9号在低磷胁迫下果糖、葡萄糖和蔗糖在叶和茎中均增加,而番茄品系30号则相反。对番茄糖类代谢起到主要作用的是蔗糖中性和酸性转化酶。转化酶活性在番茄品系30号品系有不同程度的降低,而番茄品系9号品系中转化酶活性主要在根中降低,茎叶中较高。SUT的基因表达结果表明蔗糖转运蛋白在低磷处理的24 h内,各基因表达变化显著,在番茄品系9号的叶和茎中SUT1的表达较高,根中SUT2表达较高,而SUT4在叶中表达较高。这一结果说明,低磷胁迫下番茄植株地上部的光合作用受到影响,导致碳水化合物水平的改变,进而影响了蔗糖转运蛋白的表达及对蔗糖在植株的分配,最终影响了植株对低磷胁迫响应的不同。本实验结果为阐明番茄适应低磷的机制,选育开发低磷养分高效吸收型的作物品种,提高养分利用率提供重要的理论与实践依据。     

巴西橡胶树HbCytc1的克隆及表达分析

橡胶树寒害和干旱逆境响应均与活性氧代谢和淬灭有关,研究表明细胞色素c1通过参与抗坏血酸的再生在抗旱、活性氧淬灭等逆境中发挥作用。为研究细胞色素c1基因在橡胶树寒害和干旱逆境响应中的作用机制,采用5'/3'末端快速扩增技术从巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片中克隆了一个细胞色素c1基因,通过生物信息学软件分析,可知其推导氨基酸含有特征性Cyt_c1家族结构域,将其命名为HbCytc1。HbCytc1全长1 351 bp,ORF933 bp。根据c DNA序列推导出该蛋白氨基酸,利用DNAman与其他植物中的同源Cytc1基因进行序列比对,发现橡胶树HbCytc1与蓖麻RcCytc1(XP_002509561.1)、毛果杨PtCytc1(XP_002313590.1)、克莱门柚CcCytc1(XP_006441506.1)和烟草NsCytc1(XP_009804309.1)氨基酸的相似性分别为91%、92%、89%和87%。系统进化分析显示,HbCytc1与RcCytc1、PtCytc1位于同一分支。表达分析结果显示,该基因在花、叶片和胶乳中表达,在树皮中不表达。在干旱、机械伤害和白粉菌侵染处理下,均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。结果表明HbCytc1受逆境反应诱导,参与橡胶树抗逆过程。为揭示细胞色素c1的功能和橡胶树抗逆响应的研究提供理论指导。