美洲黑杨CCoAOMT基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

据已报道的CCoAOMT(caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase)基因的eDNA序列设计一对兼并引物,从美洲黑杨当年生嫩枝的次生木质部中提取总RNA,通过RT-PCR的方法获得约750 bp的特异性扩增产物.测序结果显示,克隆的序列与GenBank中注册的CCoAOMT基因cDNA同源性最高达99%.该基因的cDNA序列已在GenBank上登录(登录号:EF153198).将克隆的美洲黑杨CCoAOMT基因的cDNA序列反向连接到植物表达载体pBI121中CaMV35S启动子的下游,成功构建了美洲黑杨CCoAOMT基因的反义表达载体pBI-CCoAOMT,为进一步通过反义技术降低杨树木质素含量奠定了基础.     

番茄ACC氧化酶基因cDNA的克隆及三种植物表达载体构建

乙烯在植物生长发育过程中发挥着重要的作用.ACC氧化酶是乙烯生物合成途径的限速酶.通过反义基因工程调控ACC氧化酶基因的表达,进而起到调控乙烯的生成是乙烯研究的主要途径.本研究采用RT-PCR方法获得番茄ACC氧化酶基因cDNA序列1 018 bp,构建该基因的正义、反义、RNAi表达载体,通过电转化法导入农杆菌LBA4404中.     

金花茶CnBCH基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

利用CODEHOP和RACE方法,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了β-胡萝卜素环羟化酶(β-carotene hydroxylase,BCH)基因的cDNA全长,命名为CnBCH。碱基序列分析结果表明,该CnBCH基因全长1 089 bp,包含58 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、105 bp的3'UTR和927 bp编码308个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质为不稳定亲水性蛋白,分子量为34.42 k D,无信号肽,含有4个跨膜结构域,一个脂肪酸羟化酶超家族(FA_hydroxylase super family)功能结构域以及BCH功能结构域(PLN02601);CnBCH二级结构以α-螺旋为主,其次为无规则卷曲,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnBCH与茄科、蔷薇科等植物BCH蛋白同源性都在70%以上,与柿树(Diospyros kaki T.)BCH同源性最高。本研究为进一步了解CnBCH基因的功能及其在金花茶花瓣类胡萝卜素合成中的作用提供了帮助。     

苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建

合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理,通过RT-PCR和RACE方法克隆苋菜PCS基因。序列分析表明:苋菜PCS基因cDNA全长1 770 bp,包含完整的阅读框,编码485个氨基酸;苋菜PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜PCs合成酶相似性为91.96%～95.67%,其氨基酸序列N端有1个Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C端有1个Pfam:Phytochelatin_C结构域(功能为重金属离子感应器)。因此,推断苋菜PCS基因编码蛋白是PCS-like家族的新成员,具有催化合成植物络合素的功能,将它在GenBank注册,序列号为:JN979370,命名为AmPCS。在AmPCS基因的编码区加入BamH I和Sac I酶切位点,双酶切植物表达载体pBI-121和带有酶切位点的PCR产物,成功获得苋菜PCS基因正义表达载体pBI-PCS。     

脐橙CsCAB基因的克隆及表达载体构建

从脐橙果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,获得了一个CAB基因家族的同源EST序列,通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法成功克隆得到984bp的CsCAB全长基因(GenBank登录号EF010854)。序列分析结果表明,CsCAB包含一个621bp的开放阅读框(ORF),编码207个氨基酸;CsCAB蛋白与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand。并构建了脐橙CsCAB基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA1301-CABs和pCAMBIA1301-CABas,为该基因的功能研究奠定了基础。     

甘蔗ScPCaP1基因cDNA的克隆及RNAi载体的构建

拟南芥At PCa P1(protein bind calcium ions attaches to the plasma membrane,PCa P1)基因编码一个定位于细胞质膜上能结合钙离子且具有亲水性的跨膜蛋白,其参与协助了病毒粒子在植物胞间连丝中的运动,缺失该基因可导致芜菁花叶病毒在拟南芥中的累积量下降。本研究在甘蔗转录组数据库中搜索到与At PCa P1具有一定同源性的部分序列,并利用RACE(Rapid amplication of c DNA ends,RACE)技术从甘蔗品种台糖22的总RNA中克隆出完整的c DNA,命名为Sc PCa P1,Gen Bank收录号为KT891986。Sc PCa P1基因的c DNA全长为1 159 nt,5'端非编码区和3'端非编码区分别含有145 nt和312 nt,编码区包含一个702 nt的开放阅读框(Open reading frame,ORF),预测编码一个234个氨基酸的蛋白质,其分子量约为24.7 k D。同源性分析表明Sc PCa P1与拟南芥At PCa P1编码的蛋白的一致性为53.6%,与玉米和高粱的PCa P1蛋白一致性较高,分别是80.8%和85.2%。本研究进一步构建Sc PCa P1基因的RNAi(RNA interference)载体,用于后续研究Sc PCa P1在甘蔗抗病毒育种方面的作用及其他功能。     

转录调控基因GmLEC1的cDNA克隆及其植物表达载体的构建

以高油大豆中豆32 开花后30 d的种子为材料,根据已报道的拟南芥脂肪酸合成相关转录因子LEC1序列设计简并引物,采用同源序列法从大豆种子中分离了大小为850 bp的cDNA片段,测序结果表明,该片段与拟南芥中已克隆的脂肪酸合成基因高度同源,包含完整的读码框,采用酶切连接和gateway技术构建了该基因的超量表达和RNAi植物表达载体.为借助农杆菌介导法将LEC1基因转化到大豆再生植株中,对分离的LEC1基因进行功能验证,培育高油大豆新品种奠定了基础.     

香稻PRO基因的克隆及表达载体的构建

利用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在水稻中特异性表达的脯氨酸氧化酶(PRO)基因.DNA序列分析表明,所获得水稻的PRO cDNA的最大开放阅读框序列全长为1 428 bp,可编码476个氨基酸.该序列与NCBI网站上已发表的PRO基因100%相似.为了能进一步验证所克隆的序列是我们所需的目的基因,成功构建了PRO基因超表达载体和PRO基因干涉载体,便于导入水稻中进行基因的功能鉴定.     

牡丹PsMDH基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹苹果酸脱氢酶基因cDNA全长,命名为PsMDH,GenBank登录号为HQ449567.其cDNA全长1283 bp,包含80 bp的5′非编码区、203 bp的3′非编码区和一个长度为999 bp编码332个氨基酸的开放阅读框.序列比对和系统进...     

菊花MADS-box基因的克隆与表达载体构建

为了给菊花CmFUL基因功能鉴定与遗传改良奠定基础,采用RT-PCR法从菊花叶片中克隆出1个MADSboxA类基因的编码区序列,命名为CmFUL(Gen Bank登录号KT894379)。CmFUL基因编码区ORF片段长度为741 bp,编码246个氨基酸。CmFUL蛋白属于亲水性蛋白,预测该蛋白内含12个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmFUL蛋白与CMD41蛋白的相似性为95.6%,同属于AP1/FUL亚家族的FUL-like进化枝。实时荧光定量PCR分析表明,CmFUL基因在花期不同组织中均有表达,但表达丰度不一。在花蕾中表达量最高,其次是管状花,根和舌状花中痕量表达;同一朵花中管状花的表达量约为舌状花中的12倍。分析认为,CmFUL可能在促进开花及子房建成中起重要作用。将CmFUL基因连接到p CAMBIA1300载体上,成功构建了高效植物表达载体。     

菠萝AcMYB44基因的克隆及植物表达载体构建

为研究R2R3-MYB转录因子家族成员AcMYB44基因在菠萝非生物胁迫过程作用机制,利用PCR技术从菠萝品种‘手撕菠萝’叶片中克隆AcMYB44并利用生物信息学对其结构及功能进行分析。结果表明,克隆获得的AcMYB44基因cDNA序列全长1 048 bp,开放阅读框(ORF)为771 bp,编码256个氨基酸。AcMYB44编码一个无信号肽、无跨膜结构且定位于细胞核的不稳定亲水蛋白,存在两个SANT保守结构域,属于R2R3-MYB家族。系统进化分析表明,AcMYB44与AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73、AtMYB77、GmMYB73、MsMYB44、CeMYB44、DcMYB44亲缘关系较近且聚类为S22亚族。模式植物中研究表明S22亚族成员与抗逆相关。利用同源重组的方法构建了绿色荧光蛋白融合表达载体pGREEN-AcMYB44-ORF-GFP。以上结果为深入研究AcMYB44基因在菠萝中的功能奠定基础。     

扁桃AcAGL15基因的克隆及植物表达载体构建

以新疆栽培扁桃品种‘双果’为材料,通过RT-PCR技术克隆得到一个AGL15转录因子编码基因,命名为Ac AGL15,GenBank登陆号为KU167496。通过生物信息学分析,该基因序列全长765 bp、编码255个氨基酸多肽,为不稳定的亲水性蛋白,推测蛋白分子质量为28.77 k D,亚细胞定位于细胞核中,分析表明该基因有保守的MADS box和K-box结构域。通过PCR和双酶切验证,显示植物表达载体构建成功,为后续该基因功能的研究提供了帮助。     

萼脊兰MADS-box基因的克隆及表达载体构建

为了研究"ABC"模型的B类PI基因,探究决定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊兰花瓣总RNA,并通过RT-PCR法克隆萼脊兰PI基因的编码序列,该序列长度为633 bp,编码210个氨基酸,与小兰屿蝴蝶兰的氨基酸相似性最高。对PI所表达蛋白质的结构、亲水性和二级结构进行了分析,结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守结构域,属于MADS-box基因家族;该蛋白分子属于亲水性蛋白,包含56.19%α螺旋、13.81%的延伸链以及30%的不规则折叠,实时荧光定量PCR结果显示,PI基因主要在花器官中表达,且表达量高,说明PI基因的表达具有组织特异性。构建植物表达载体的结果显示,目的基因和带启动子的片段已插入到表达载体p CAMBIA1301中,表明成功构建植物表达载体1301-PI,为最终获得新奇花型的萼脊兰奠定基础。     

乌骨鸡黑色素基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RT-PCR方法从乌骨鸡皮肤中克隆出黑色素主效基因黑色素皮质激素受体(Melanocortin1-receptorMC1R)基因,长度为945bp,与普通白鸡比对其同源性为99.6%。以pEGFP-N1为基础,将从测序载体pMD-18T-MC1R上使用EcoR I和Sal I切下的MC1R连接到同样酶切的pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-MC1R真核表达载体,为以后转基因动物的制备打下了基础。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

蓖麻耐盐基因HKT的克隆及表达载体构建

为挖掘蓖麻耐盐相关基因,以盐生植物蓖麻(Ricinus communis L.)叶片为材料。设计特异性引物,克隆高亲和性钾离子转运蛋白(high-affinity K+transporter,HKT)耐盐基因,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,推测分子量为59.74 kD,等电点(pI)为9.32。多重序列比对和系统发育树分析表明该蛋白与木薯和橡胶树的同源性最高,分别为69.13%和67.03%,且与HKT1蛋白家族成员同源性较高,为S-G-G-G类型蛋白,推测该蛋白为HKT1类蛋白。二级结构预测蓖麻HKT蛋白有9个跨膜结构域,主要定位于内质网上,是典型的跨膜蛋白。根据蓖麻HKT基因序列设计带有Bam HⅠ和PstⅠ酶切位点的引物扩增出全长基因,用限制性内切酶Bam HⅠ和PstⅠ进行双酶切后与表达载体pCHF-3300连接。本研究成功构建了蓖麻HKT基因的表达载体,为进一步研究该基因的转化及功能验证提供参考。     

紫苏HPPR基因启动子的克隆及植物表达载体构建

以前期获得的紫苏HPPR基因的c DNA序列为模板,通过设计特异性引物和染色体步移的方法分离出HPPR基因启动子,全长2 216 bp,以此研究HPPR基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析表明,该序列中存在TATA-box和CAAT-box等典型的真核生物启动子基本元件,以及对茉莉酸甲酯、生长素、水杨酸和脱落酸等植物激素应答相关的顺式作用元件,另外也存在非生物胁迫顺式作用元件。将HPPR启动子部分缺失序列替代p BI121载体中的Ca MV35S启动子,构建了与GUS融合的启动子元件缺失表达载体。本试验的研究为该启动子在今后紫苏转基因定向改良提供了有用的候选资源。     

大豆CML38-like基因的克隆及表达载体构建

类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。