蓖麻耐盐基因HKT的克隆及表达载体构建

为挖掘蓖麻耐盐相关基因,以盐生植物蓖麻(Ricinus communis L.)叶片为材料。设计特异性引物,克隆高亲和性钾离子转运蛋白(high-affinity K+transporter,HKT)耐盐基因,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,推测分子量为59.74 kD,等电点(pI)为9.32。多重序列比对和系统发育树分析表明该蛋白与木薯和橡胶树的同源性最高,分别为69.13%和67.03%,且与HKT1蛋白家族成员同源性较高,为S-G-G-G类型蛋白,推测该蛋白为HKT1类蛋白。二级结构预测蓖麻HKT蛋白有9个跨膜结构域,主要定位于内质网上,是典型的跨膜蛋白。根据蓖麻HKT基因序列设计带有Bam HⅠ和PstⅠ酶切位点的引物扩增出全长基因,用限制性内切酶Bam HⅠ和PstⅠ进行双酶切后与表达载体pCHF-3300连接。本研究成功构建了蓖麻HKT基因的表达载体,为进一步研究该基因的转化及功能验证提供参考。     

金花茶CnBCH基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

利用CODEHOP和RACE方法,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了β-胡萝卜素环羟化酶(β-carotene hydroxylase,BCH)基因的cDNA全长,命名为CnBCH。碱基序列分析结果表明,该CnBCH基因全长1 089 bp,包含58 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、105 bp的3'UTR和927 bp编码308个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质为不稳定亲水性蛋白,分子量为34.42 k D,无信号肽,含有4个跨膜结构域,一个脂肪酸羟化酶超家族(FA_hydroxylase super family)功能结构域以及BCH功能结构域(PLN02601);CnBCH二级结构以α-螺旋为主,其次为无规则卷曲,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnBCH与茄科、蔷薇科等植物BCH蛋白同源性都在70%以上,与柿树(Diospyros kaki T.)BCH同源性最高。本研究为进一步了解CnBCH基因的功能及其在金花茶花瓣类胡萝卜素合成中的作用提供了帮助。     

蓖麻质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(RcSOS1)克隆及表达载体构建

根据其他物种中保守的SOS1基因序列,设计简并引物,利用RT-PCR和RACE的方法克隆得到RcSOS1(NCBI注册号:KX943304.1)基因序列,开放阅读框包含3 432个核苷酸,推导编码的蛋白质有1 143个氨基酸残基组成,与麻疯树SOS1基因的同源性最高,达到了80.4%,编码一种Na~+/H~+逆向转运蛋白。疏水性分析显示RcSOS1基因编码蛋白N-末端具有12个跨膜结构域,C-末端具有一个很长且面向质膜内腔的亲水尾部。RcSOS1蛋白二级结构以α-螺旋,无规则卷曲为主,其次为延伸链和β-转角,所占比例最少。三级结构分析表明,RcSOS1蛋白是位于质膜上的Na~+/H~+逆向转运蛋白。根据RcSOS1全长序列设计带有Bam HⅠ和SalⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用Bam HⅠ和SalⅠ双酶切后与表达载体p CG-1301连接,成功构建了RcSOS1基因的正义表达载体,为深入研究RcSOS1基因的功能及耐盐的调控作用提供了帮助。     

苎麻C3H基因的克隆、生物信息学分析及表达分析

旨在为后期验证C3H基因编码蛋白功能并最终实现低木质素优良苎麻品种的基因工程育种奠定基础。基于苎麻高通量测序信息,利用RACE技术克隆C3H基因全长序列,对其进行生物信息学分析;并利用荧光定量技术对苎麻C3H的表达模式进行研究。获得了全长为1940 bp的苎麻C3H基因c DNA序列Bn C3H-1(Gen Bank登录号为KY078743)。Bn C3H-1基因编码蛋白理化性质和结构的分析表明,该基因编码一个含511个氨基酸,分子量为57.80 k D的亲水性蛋白,它可能定位在内质网上。氨基酸序列和结构分析显示Bn C3H-1有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与巨桉和苦荞C3H基因具有很高的同源性。     

金花茶黄烷酮3-羟化酶基因CnF3H的克隆及表达分析

本研究利用反转录PCR和RACE方法,从中国珍稀濒危植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中获得了黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因的c DNA全长,命名为Cn F3H,Gen Bank登录号为HQ290517。碱基序列分析表明,该Cn F3H基因c DNA序列全长为1 360 bp,5'非翻译区(untranslated regions,UTR)长54 bp,3'UTR长202 bp,开放阅读框长为1 104 bp编码367个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,Cn F3H与茶(C.sinensis)F3H同源性高达99%。二级结构预测表明,无规则卷曲在Cn F3H蛋白结构中所占比例最大,其次为α-螺旋和延伸链。相对荧光定量PCR分析表明,Cn F3H基因的表达量在幼蕾期、初蕾期和膨大期的表达量较高,之后逐渐降低;Cn F3H基因在花器官不同部位中均有表达,其表达量高低顺序为雄蕊、花瓣、萼片、雌蕊和苞片。本研究为全面深入地研究金花茶花色形成的分子调控机理提供了充实的理论依据。     

黄灯笼辣椒CcCAD1基因的克隆与植物表达载体的构建

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)在木质素生物合成中有着重要作用,为了探讨辣椒中CAD基因在木质素合成中的作用,本研究利用RT-PCR方法从黄灯笼辣椒幼嫩叶片中克隆得到CAD1基因全长cDNA,命名为CcCAD1。序列分析表明,CcCAD1 cDNA序列全长1 074 bp,编码357个氨基酸。同源比对显示其与番茄CAD1蛋白的一致性高达96.09%。荧光定量PCR检测结果显示,CcCAD1基因在辣椒根、茎、叶、胎座和果肉中的表达量差异显著,其相对表达量为叶果肉茎根胎座。利用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切连接成功构建pBI121-CcCAD1植物表达载体,为CcCAD1基因转化以及后续的功能分析提供依据。     

油茶花青素还原酶基因克隆和体外功能研究

花青素还原酶(ANR)是催化花青素还原形成单体儿茶素的关键酶。油茶(Camellia oleifera Abel.)属于山茶科山茶属植物,其花青素还原酶基因尚未被克隆和功能分析。本研究采用RT-PCR技术,克隆获得了两条油茶花青素还原酶基因的全长序列,CoANR1基因全长1441bp,开放阅读框(ORF)长度为1047bp,编码348个氨基酸残基,与茶树ANR1基因的蛋白序列同源性为97%;CoANR2基因全长1413bp,ORF框长度为1014bp,编码337个氨基酸残基,与茶树ANR2基因的蛋白序列同源性为99%。采用大肠杆菌表达方法获得CoANR1和CoANR2重组蛋白,纯化蛋白经体外酶活检测能够催化矢车菊色素合成儿茶素(C)和表儿茶素(EC),催化飞燕草色素合成没食子儿茶素(GC)和没食子表儿茶素(EGC)。本研究为进一步研究油茶儿茶素合成的分子机制提供了重要的研究基础和理论依据。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

越南油茶环阿屯醇合酶基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆的方法克隆得到环阿屯醇合酶基因全长并命名为CvCAS,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvCAS全长2 411 bp,包括一个2 277 bp完整的开放阅读框,编码758个氨基酸,与茶(Camellia sinensis)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis var. chinensis),刺楸(Kalopanax septemlobus)和人参(Panax ginseng)的CAS蛋白序列相似度均在85%以上,系统发育树分析显示CvCAS与茶(Camellia sinensis)和向日葵(Helianthus annuus)的CAS蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为86.6 kD,理论等电点为6.20,无跨膜螺旋区,属于不稳定亲水性蛋白。序列比对分析表明,CvCAS具有氧化鲨烯环化酶(OSCs)超家族典型结构位点(DCTAE),三萜合成酶高度保守结构...     

甘薯番茄红素β-环化酶基因的克隆与转化烟草的研究

番茄红素β-环化酶（LYC-B）催化番茄红素形成β-胡萝卜素，是β-胡萝卜素生物合成的关键酶之一。从甘薯块根总RNA逆转录的cDNA中扩增出lyc-b的保守序列后，用cDNA末端快速扩增方法（RACE）获得了该基因全长cDNA，共1 844 bp，开放阅读框1 503 bp，编码501个氨基酸。构建了lyc-b植物表达载体p23-lyc-b，通过农杆菌介导法转化烟草，经PCR及Southern杂交表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

越南油茶HMGCR基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中HMGCR (3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆得到HMGCR基因全长并命名为CvHMGCR,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvHMGCR全长1 800 bp,包括一个1 770 bp完整的开放阅读框,编码589个氨基酸,与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)、喜树(Camptotheca acuminata)、风铃辣椒(Capsicum baccatum)和三七(Panax notoginseng)的HMGCR蛋白序列相似度均在75%以上,系统发育树显示Cv HMGCR与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)和喜树(Camptotheca acuminata)的HMGCR蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为63.1kD,理论等电点为6.37,有两个跨膜螺旋区,属于不稳定疏水性蛋白。序列比对分析表明,CvHMGCR有4个...     

火把梨14-3-3基因的克隆与序列分析

依据火把梨(Pyrus pyrifolia Nakai)14-3-3蛋白的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE),从云南火把梨中克隆一个新的14-3-3基因(Pp14-3-3)的全长cDNA序列。Pp14-3-3全长cDNA为1 107 bp,具有84 bp 5’非编码区(Untranslated Regions,UTR)、786 bp开放读码框(Openreading frame,ORF),以及237 bp 3’UTR,编码含261个氨基酸的蛋白质。Pp14-3-3与其他物种14-3-3蛋白在中间功能区域高度保守,包含典型的14-3-3结构域。与已知植物14-3-3s家族成员间的氨基酸序列进行聚类分析,将Pp14-3-3聚为非ε大类14-3-3。Pp14-3-3在火把梨接受光照和没有光照的果皮以及幼嫩叶片中大量表达,且表达量稳定。对Pp14-3-3的基因克隆以及表达特性进行了分析,为后期深入研究该新基因的功能奠定了基础。     

白芨环阿屯醇合酶基因BsCAS的克隆及序列分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)在植物甾醇和三萜类物质的合成途径中发挥重要调节作用,研究白芨环阿屯醇合酶BsCAS的序列信息,为进一步研究环阿屯醇合酶的功能奠定基础。基于白芨转录组数据,利用RT-PCR技术扩增BsCAS基因的CDS全长,通过生物信息学软件分析BsCAS蛋白的理化性质和结构特征,并进行氨基酸多序列比对分析与系统进化树分析。结果表明扩增获得的Bs CAS基因CDS全长为2 277 bp,编码758个氨基酸。BsCAS蛋白是无跨膜结构无信号肽的亲水性蛋白,BsCAS蛋白具典型的DCTAE结构域和QW结构域,属于氧化鲨烯环化酶超基因家族成员。BsCAS与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的CAS蛋白具有很高的同源性,亲缘关系最近,并聚为一支。对白芨Bs CAS基因的克隆和序列特征分析为进一步阐明BsCAS基因在调控植物甾醇类物质合成途径中的功能提供数据支持。     

甘蓝型油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)的克隆与真核表达载体的构建

根据已知的拟南芥甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH1)序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆出油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)全长。测序和分析结果表明,BnBADH-1的cDNA全长1506bp,编码一个包含501个氨基酸残基、分子量为55kD、等电点(pI)为5.16的假定蛋白质;核酸序列和氨基酸序列与拟南芥的同源性分别为90.24%和93.41%。利用片段两端的粘性末端酶切位点BamHⅠ和SacⅠ将cDNA片段连接在真核表达载体pBI121上;PCR鉴定表明,过量表达载体pBI121-BnBADH-1已成功构建,为下一步的基因功能分析做好了准备。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

利用RT-PCR和RACE技术从飞机草中克隆得到1628 bp的类黄酮3’-羟化酶c DNA的全长序列,命名为Co F3’H,Gen Bank登录号为HQ268505.1。Co F3’H基因的编码区长度为1524 bp,编码507个氨基酸。氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G),利用DNAMAN软件比对显示,Co F3’H与其他植物的F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将Co F3’H基因导入烟草,T2代的转Co F3’H基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。说明Co F3’H在黄酮的生物合成中起重要作用,为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。     

马尾松PmTIR1基因的克隆及编码蛋白质的结构预测

TIR1(transport inhibitor response 1)基因在生长素信号转导途径中发挥重要作用。本研究采用PCR技术和RACE技术,利用Primer Premier5进行引物设计,从马尾松中克隆出TIR1基因的全长c DNA序列,命名为Pm TIR1。此c DNA全长2 446 bp,包括1 725 bp完整的ORF,能够编码含有574个氨基酸的蛋白,此蛋白相对分子质量为64 240.3 u,等电点为6.76。利用Clustal X、ANTHEPROT和DNAMAN等软件分析Pm TIR1序列及其编码的氨基酸序列,结果表明:马尾松Pm TIR1蛋白氨基酸序列与火距松TIR1蛋白同源性高达99%,Pm TIR1蛋白含有F-box结构域和多个LRR结构域;Pm TIR1蛋白的F-box结构域可能与SCFTIR1中SKP1结合,它符合F-box家族的特点。利用实时定量技术得知Pm TIR1在马尾松嫩根、嫩茎、嫩叶中都有表达,在嫩叶中表达量最高、嫩根中次之、嫩茎中最低。本研究可为生长素调控马尾松生长发育相关机理提供理论依据。     

脐橙CsCAB基因的克隆及表达载体构建

从脐橙果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,获得了一个CAB基因家族的同源EST序列,通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法成功克隆得到984bp的CsCAB全长基因(GenBank登录号EF010854)。序列分析结果表明,CsCAB包含一个621bp的开放阅读框(ORF),编码207个氨基酸;CsCAB蛋白与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand。并构建了脐橙CsCAB基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA1301-CABs和pCAMBIA1301-CABas,为该基因的功能研究奠定了基础。     

棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析

 以棉花EST序列分析为基础,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花中克隆了2个新的F box蛋白基因,分别命名为GhFB1 (GenBank核酸数据库登录号：EF419428)和GhFB2 (GenBank登录号：EF503623)。GhFB1cDNA全长866bp,编码162个氨基酸;GhFB2 cDNA全长657bp,编码161个氨基酸,而且两者均含有植物F-box蛋白家族特有的F-box结构域。序列比较分析表明,GhFB1和GhFB2蛋白与水稻OsGID2,拟南芥AtSLY1具有高同源性,是棉花中F-box蛋白家族的新成员。RT-PCR结果表明,GhFB1和GhFB2在根、下胚轴、叶、茎、花和纤维中都有表达,而且均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测这2个基因在棉纤维早期发育中可能起重要作用。     

TcLr35小麦β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长的克隆及分析

根据已发表的植物β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长,命名为PR34,该基因全长序列为1416bp,具有一个编码335个氨基酸的开放阅读框(ORF),其起始密码子ATG位于13bp处,终止密码子TAG位于1015bp处,3'末端有20bp的poly(A)尾,379bp的3'非翻译区。与GenBank中小麦、大麦等多个葡聚糖苷酶基因具有较高同源性;对其推断的氨基酸序列进行分析,含有Glyco_hydro_17保守结构域,为葡聚糖苷酶基因蛋白结构域。Southern杂交显示,该基因在TcLr35小麦基因组中为低拷贝。