新疆绵羊及其环境中李氏杆菌的生态分布多样性调查

对新疆健康绵羊及其相关环境如青贮饲料、饮水、土壤、鸟粪中李氏杆菌(Listeria)种群采用改良国标法(4789.30-2010)进行生态分布多样性调查,并对分离的单核细胞增多性李氏杆菌(L.monocytogenes)采用PCR方法进行溶血素基因(hly)和血清型检测。结果:514份样本中,共检出阳性样本26份,平均阳性率为5.1%,其中羊体分离率为6.2%(22/353),饮水分离率为33%(2/6),鸟粪分离率为3.0%(2/67),其余样本均为阴性;26份阳性样品中,检出单核细胞增多性李氏杆菌5株,塞氏李氏杆菌(L.seeligeries)21株,且5株单核细胞增多性李氏杆菌均检出溶血素基因,血清型为1/2a。     

检测产单核细胞李氏杆菌溶血素的胶体金试纸条制备及初步应用

产单核细胞李氏杆菌为重要的食源性病原菌,本研究旨在建立快速、灵敏、特异的检测方法,提高检测效率和检测通量。李氏杆菌溶血素(LLO)蛋白经原核表达后, 制备单克隆抗体, 测定单克隆抗体的亚型、效价及亲和力。柠檬酸钠法研制LLO胶体金试纸条,并对试纸条的特异性、敏感性、重复性、稳定性及模拟样品进行检测,并初步应用于实际海产品的检测。结果发现,制备的LLO单克隆抗体特异性强、稳定性高、重复性佳、灵敏度较高,亲和力好,亲和力常数为4.25×10⁸ L·mol^－1。人工污染样品试验表明灵敏度与纯细菌培养物基本一致,为3.0×10⁵CFU·mL^-1。将LLO胶体金试纸条应用于500份海产品的实际检测中,产单核细胞李氏杆菌的阳性检出率为2.20% (11/500),略低于国标检测方法(GB4789.30—2010)的2.40%(12/500)和PCR检测方法的2.40%(12/500),三者之间符合率为91.67%。另外缩短检测时间至15 min,检测效率大幅度提高。本研究建立的LLO胶体金检测方法可用于产单核细胞李氏杆菌的快速检测。     

李氏杆菌溶血素基因的表达及活性分析

根据LMO溶血素基因hlyA设计引物,PCR扩增hlyA,将扩增产物与pMD18-T连接,重组质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序。将由重组质粒pMD18-hlyA上扩增的缺失信号肽序列的目的片段与表达载体DGEX-4T-1分别酶切连接后,转化BL21细胞。筛选阳性克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,纯化重组融合蛋白进行溶血试验、小鼠致病力试验和间接ELISA分析。结果表明hlyA基因在大肠杆菌中成功表达分子量82Ku的融合蛋白,能裂解红细胞,且能被LMO阳性血清所识别。一定剂量腹腔注射能将小鼠致死。以此为包被抗原的间接ELISA可以将LMO阴、阳性血清分开。这表明GST-LLO融合蛋白具有良好的生物活性,可用于李氏杆菌病的间接ELISA诊断。     

重组产单核细胞李斯特菌溶血素的应用研究

李氏杆菌溶血素(Listeriolysin,LLO)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子,为探索LLO的免疫保护性和作为诊断抗原的可行性,本研究用重组LLO抗原和单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)全菌分别免疫BALB/c小鼠和家兔,定期采血,ELISA检测抗LLO的抗体水平,并分别对免疫和对照动物攻毒致死剂量的LM,分析重组LLO抗原的免疫保护性。结果表明,小鼠和家兔在二免后10~20 d内LLO的抗体即可达到峰值,而且免疫动物能有效抵抗LM的感染。因此,重组LLO不仅可以用作动物LM的诊断抗原,而且具有作为基因工程疫苗的潜力。     

大捻角羚羊体内李氏杆菌的分离鉴定

从急性死亡的大捻角羚羊内脏器官和肠道分离到一株疑似李氏杆菌的菌株，通过细菌的形态特征、培养及生化特性，菌敏试验，以及动物回归试验等鉴定为单核细胞增多症李氏杆菌。该菌是一种革兰氏阳性兼厌氧的球杆菌，其生长的营养要求不苛刻，血平板上呈β溶血，能发酵多种糖醇类，产酸不产气。     

内化素在产单核细胞李氏杆菌入侵宿主细胞过程中的作用

单核细胞增生李氏杆菌是一种人畜共患的革兰阳性细菌。近年来,对于该细菌入侵宿主细胞方面取得诸多成就。内化素作为一个蛋白家族在入侵过程中发挥重要作用。本文就内化素家族主要成员及其受体的作用机制进行简要综述,以期为李氏杆菌病防控中寻找理想药物靶点起到指导作用。     

应用PCR检测单核细胞增多症李氏菌的研究

以二对位于单核细胞增多症李氏菌β－溶血素基因内的２６－ｂｐ寡核苷酸为引物，用ＰＣＲ对单核细胞增多症李氏菌进行了检测，结果所有株单核细胞增多症李氏菌均扩增出１８６－ｂＰ的特异条带，其它种李氏菌和细菌均呈阴性反应。本方法可测出模拟肉样中少至９２个细菌，模拟奶样中少至１８个细菌，其特异性和敏感性不受其它污染杂菌ＤＮＡ的影响。对市售猪肉和牛奶的检测结果表明，ＰＣＲ法优于传统的分离培养法，具有快速、简便和敏     

抗柱状黄杆菌多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

为制备抗柱状黄杆菌多克隆抗体,本研究利用颗粒性抗原免疫新西兰白兔,收集的抗血清通过辛酸-硫酸铵法纯化,采用间接ELISA法检测纯化后多克隆抗体的效价和交叉反应性。结果显示,制备的多克隆抗体蛋白质浓度为29.28 mg/mL,效价在1:6.4×10⁴以上,与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及哈维氏弧菌等水生动物致病菌均无交叉反应。本研究成功建立了抗柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法,可用于柱状黄杆菌的快速检测。     

产单核细胞李氏杆菌突变株的感染动力学研究

以BALB/c小鼠为实验动物模型,对actA基因和plcB基因双缺失的产单核细胞李氏杆菌（LM）yzuLM1-2菌株进行感染动力学研究。分别用减毒突变株yzuLM1-2和野生型菌株yzuLM4给BALB/c小鼠静脉注射或灌服,并对脏器中LM的分布动态进行测定。结果显示,在显著高于野生型菌株感染剂量的条件下注射或灌服接种后,减毒突变株组小鼠肝和脾中的LM数量迅速下降,被清除的速度显著快于野生型菌株组。溶血素（LLO）抗体的测定结果显示,减毒突变株菌能和野生型菌同样激发较高水平的抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,减毒突变株免疫组对同种血清型LM的攻击具有较好的免疫保护力,可达100%。结果表明,yzuLM1-2突变株侵袭力下降,致病力降低,能激发较高水平的抗体产生,可以作为预防动物李氏杆菌病的候选疫苗菌株,并为用作运送外源保护性抗原的载体提供了材料。     

牛源化脓隐秘杆菌溶血素的重组表达及其间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测牛源化脓隐秘杆菌抗体的间接ELISA检测方法,试验对分离的牛源化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin, PLO)基因序列进行分析,截去信号肽与跨膜区域后进行碱基优化,合成PLO基因片段,连接至原核表达载体pET-30a中,转化至Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态后诱导表达并纯化,以纯化后的重组蛋白作为抗原包被96孔板,建立牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体间接ELISA检测方法,确定检测方法的临界值、特异性、敏感性、重复性,并用建立的方法对临床血清样本进行检测。结果表明：成功构建了重组原核表达质粒pET30a-PLO,实现了重组蛋白在Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态中的表达,并建立了用于检测牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA检测方法。该检测方法的临界值为0.354,与常见牛细菌阳性血清无交叉反应,阳性血清稀释至320倍检测仍高于临界值;批内、批间检测变异系数均小于5%;对10份已知阳性血清进行检测,阳性检出率为100%,80份临床牛血清的阳性检出率为21.25%(17/80)。说明该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可用于牛源化脓隐秘...