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针对我国狂犬病临床诊断的现实需求,本研究根据狂犬病病毒基因组核苷酸保守序列,设计巢式引物,对引物工作浓度和退火温度进行了优化,并对RT-PCR敏感性、特异性和重复性进行了检验.结果显示,巢式RT-PCR方法最低能够检测0.01 MILD50/30μL的脑组织病毒量,对阳性样品和非狂犬病感染样品的3次重复检测结果均与狂犬病诊断OIE推荐方法(荧光抗体染色法)的确定结果完全一致;在针对203份临床样品的检测中,FAT疑似样品通过MIT和巢式RT-PCR进一步确诊,巢式RT-PCR显示出较高的敏感性和特异性.以上表明,本研究建立的狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR方法高度敏感和特异,可以用于FAT和MIT疑似样品的辅助检测,为试剂盒的研发与应用奠定基础. 相似文献
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伪狂犬病病毒弱毒株LY株的分离鉴定 总被引:2,自引:1,他引:2
从辽阳某猪场的10日龄仔猪中分离到1株病毒,经纯化后测得其毒价为107.29TCID50/mL.细胞中和试验表明,该病毒能被猪伪狂犬病病毒标准阳性血清所中和.电镜下可见到典型的疱疹病毒粒子,具有囊膜及外周纤突.所分离的病毒对氯仿、胰蛋白酶、乙醚敏感,在pH5.0~9.0下稳定,56℃ 30 min可以灭活.应用特异性引物,通过PCR能扩增出伪狂犬病病毒1 240 bp的gD基因.分离病毒对3日龄乳鼠有一定的致病力,但对家兔、3~5日龄仔猪及妊娠母猪都有很高的安全性.用不同剂量的病毒培养液肌肉注射于3~5日龄仔猪,14 d后用105.7TCID50伪狂犬病病毒强毒攻击,所有试验仔猪均可得到有效保护.用分离毒免疫母猪,其后代可获高滴度的母源抗体,15日龄的仔猪能抵抗105.7TCID50强毒的攻击.试验的结果初步说明,所分离的病毒为伪狂犬病病毒(命名为PRV LY株),并可能是一株弱毒株,而且具有很好的免疫保护作用. 相似文献
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从辽阳某猪场的10日龄仔猪中分离到1株病毒,经纯化后测得其毒价为10^7.29TCID50/mL。细胞中和试验表明,该病毒能被猪伪狂犬病病毒标准阳性血清所中和。电镜下可见到典型的疱疹病毒粒子,具有囊膜及外周纤突。所分离的病毒对氯仿、胰蛋白酶、乙醚敏感,在pH5.0-9.0下稳定,56℃ 30min可以灭活。应用特异性引物,通过PCR能扩增出伪狂犬病病毒1240bp的gD基因。分离病毒对3日龄乳鼠有一定的致病力,但对家兔、3—5日龄仔猪及妊娠母猪都有很高的安全性。用不同剂量的病毒培养液肌肉注射于3—5日龄仔猪,14d后用10^5.7TCID50伪狂犬病病毒强毒攻击,所有试验仔猪均可得到有效保护。用分离毒免疫母猪,其后代可获高滴度的母源抗体,15日龄的仔猪能抵抗10^5.7TCID50强毒的攻击。试验的结果初步说明,所分离的病毒为伪狂犬病病毒(命名为PRVLY株),并可能是一株弱毒株,而且具有很好的免疫保护作用。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒HDDJ株的分离鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
广东省某猪场常规免疫猪伪狂犬病疫苗(Bartha-K61株)的母猪流产,疑似为猪伪狂犬病病毒感染。为确定发病原因,将流产胎儿的脑、淋巴结、肺脏研磨混合液接种Vero细胞,形成稳定细胞病变(CPE),并测定其细胞半数感染量(TCID50),通过PCR鉴定、测序比对、进化树分析,确定感染病毒及基因型,动物回归实验判定病毒致病性。结果表明,分离毒株为PRV中国变异株,命名为HDDJ株,与猪伪狂犬病疫苗Bartha-K61株亲缘关系较远。 相似文献
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2013年下半年,福建某免疫接种过猪伪狂犬病疫苗(Bartha)的规模化猪场大批妊娠母猪发生流产、新生仔猪发生共济失调的神经症状,疑似为猪伪狂犬病病毒感染发病症状,为确定发病原因,从该猪场疑似伪狂犬病病毒感染的仔猪脑、肝脏和肺脏中分离到一株未知病毒,PCR检测及测序比对鉴定为猪伪狂犬病病毒,并将分离的病毒命名为NP株。用Reed-Muench法测定分离株病毒的组织细胞半数感染量(TCID50)为10-9.13/0.1mL,动物攻毒试验出现猪伪狂犬病病毒感染的典型症状。试验结果表明,成功分离到一株猪伪狂犬病病毒毒株,为研究福建省猪群伪狂犬病病毒分子流行病学奠定基础。 相似文献
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从辽宁某猪场采集病料,经处理后接种BHK-21细胞进行猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10-7.8 TCID50/mL。间接免疫荧光试验可见黄绿色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径为140~200 nm。该病毒对氯仿、乙醚、酸和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的猪伪狂犬病临床症状且死亡。结果表明,成功分离到1株PRV。 相似文献
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从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒 ,通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK -1 5细胞上连续传 1 2代均出现典型的细胞病变 ,用适应PK -1 5细胞的病毒接种Vero细胞、猪肾传代细胞IBRS -2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感 ,在pH5 0~ 9 0下稳定 ,5 6℃ 3 0分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板 ,应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒 1 2 40bp的gD基因的特异性片段。结果表明 ,所分离病毒为伪狂犬病病毒 ,并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒LA株。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定 总被引:45,自引:11,他引:45
从湖北省某些猪场大批死亡的新生仔猪的脑及内脏中分离到的多株病毒,并用其中一代表毒株进行了全面鉴定。该病毒株在仓鼠肾传代细胞上连传15代均出现典型细胞病变,用适应BHK-21细胞的病毒接种鸡胚成纤维细胞,Hela细胞,Vero细胞,犊牛睾丸原代细胞,猪肾传代细胞IBRS-2均出现典型细胞病变,在电镜下可见到典型的伪狂犬病毒病粒子,病毒对5-碘脱氧尿核苷,氯仿,胰蛋白酶,乙醚敏感,在pH5.0~9.0 相似文献
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采用小鼠脑内接种法对保存不同年代的5批狂犬病病毒(Flury株)鸡胚低代毒(LEP)毒种进行病毒含量测定,并将每批毒种分别肌肉注射3月龄健康易感犬,21 d后采用小鼠脑内中和试验和荧光抑制试验分别测定犬血清抗体效价,评价毒种的免疫原性。结果显示,5批毒种每0.03 mL的病毒含量分别为104.67LD50、104.67LD50、103.5LD50、103.5LD50、104.17LD50;5批毒种免疫的10只犬血清抗体效价采用两种方法测定均达到1∶32以上,结果表明狂犬病病毒(Flury株)毒种在-70℃保存12年病毒含量仍符合标准规定,并保持有良好的免疫原性。 相似文献
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根据GenBank已公布的狂犬病病毒(rabies virus,RV)核蛋白(N)基因序列设计并合成一对特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的荧光RT-PCR检测狂犬病病毒方法。对狂犬病疫苗提取核酸后进行RT-PCR扩增,将目的条带切胶回收,克隆测序,重组质粒作为标准阳性对照。对建立的TaqMan探针荧光RT-PCR方法做灵敏度、特异性、重复性及稳定性试验。结果显示,该方法可以达到10拷贝/μL的灵敏度,可以将狂犬病病毒与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒分开,方法重复性好,稳定可靠。 相似文献
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本试验旨在对北京1株犬源狂犬病病毒株(BJ2012ZW株)在全基因组水平上进行分子进化研究,比较与全国流行株及疫苗株之间的差异.试验采集犬脑组织以直接免疫荧光技术和内基氏小体检查方法进行检测,以RT-PCR扩增病毒核酸覆盖全基因组,对产物测序后进行遗传学分析.结果显示,BJ2012ZW株狂犬病病毒属于基因1型,与目前中国的主要流行株全序列同源性为83.9%~99.7%.与同样分离自北京的毒株BJ2011E和CNM1101C的核苷酸全序列同源性最高(99.7%),进化关系近.G蛋白主要抗原位点分析结果表明,BJ2012ZW株与国内疫苗株相比有部分抗原位点发生了替换.BJ2012ZW株属于中国目前的流行株,与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异. 相似文献
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