含粘质沙雷氏菌几丁质酶SchiA基因的植物转化质粒pBGll12构建和水稻遗传转化

将一个2．8kb的CaMV35S启动子／SchiA编码区／Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIAl301的多克隆酶切位点,得到1个14．6kb的新植物转化质粒pBGlll2,用花器介导法转化水稻(Oryza sativa),经PCR检测,初步证实已将目的基因整合到受体植物的基冈组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)和稻瘟病(Pyricularia oryzae)的抗性较非转化对照增强。RT—PCR表明抗病性植株为阳性,而不抗病的植株为阴性。将RT—PCR产物测序后,用BLAST软件分析序列可知,该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株,表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。     

水稻几丁质酶基因的克隆及序列分析

采用ＰＣＲ技术从水稻基因组ＤＮＡ中扩增出２个编码几丁质酶基因片段ＲＣＨ１０和ＲＣＨ８,片段大小分别为１０２３ｂｐ和９７６ｂｐ。将ＰＣＲ产物直接做ＮＤＡ序列分析,证明扩增出的２个片段具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构,即（１）Ｎ－端信号肽区;（２）ｈｅｖｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ结构区;（３）可变间隙区;（４）催化结构区。其中ＲＣＨ１０的核苷酸序列与文献报道相比同源性为９７％,氨基酸序列同源性为９３％;ＲＣＨ     

转几丁质酶基因水稻根系微生物群落分析

有用“直接观察法”和“分离培养法”对转基因水稻根系微生物群落的初步分析结果表明，导入外源水稻几丁质酶基因（RC24）的转基因水稻根内和根表的微生物群落发生显著变化，转基因水稻根部内生真菌总数显著减少，内生细菌总数显著增加，其内生细菌总数是未转基因亲本对照的10倍左右。采用“直接观察法”测得2个转基因水稻品种有内生真菌的根段率为55．2％和81．1％，而对照为100％，转基因水稻根系真菌和细菌种类与对照存在显著差异，有VA菌根泡囊的根段率显著降低。     

转几丁质酶基因水稻对土壤化学性状及酶活性的影响研究

对种植转几丁质酶基因水稻“竹转68”农田土壤化学性状的变化研究结果表明，当年种植和连续2年种植转基因水稻“竹转68”农田土壤有机质、可溶性N、P以及过氧化氢酶、多酚氧化酶、蔗糖酶和脲酶活性与非转基因水稻对照相比无显著差异，且其叶片的化感作用大于非转基因水稻对照，但其腐殖过程化感效应及残体腐殖速度均小于非转基因水稻对照；经过冬季腐殖过程2种水稻土壤腐殖化程度基本一致，表明种植转基因水稻“竹转68”对水稻生产不会产毕不利影响．     

硅对水稻几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响及其与抗纹枯病的关系

在溶液培养条件下,以水稻抗病品种91SP和感病品种Lemont为材料,研究施硅和接种纹枯病菌对水稻纹枯病发生情况、外切几丁质酶、内切几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响。结果表明,施硅能降低抗病品种91SP的纹枯病病级和病情指数,显著降低感病品种Lemont的病级和病情指数。在未接种纹枯病菌条件下,施硅增加了抗病品种几丁质酶活性,增加了感病品种的几丁质酶活性,但对β-1,3-葡聚糖酶活性影响不大。接种纹枯病菌后,水稻几丁质酶活性被迅速激活后又下降,施硅通过提高抗病品种91SP几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及通过提高感病品种Lemont几丁质酶活性来增强对纹枯病的抗性,但感病品种Lemont施硅处理的几丁质酶活性降低幅度小于抗病品种91SP。     

水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究

利用RT-PCR反应,从纹枯菌诱导的水稻叶片cDNA中克隆了1个水稻几丁质酶基因RC7的全长编码序列（ORF）。通过亚克隆方法,RC7与原核表达载体pGEX-4T-1上的GST融合,构建成GST-RC7重组蛋白的原核表达载体pGST-RC7,然后,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了以包涵体形式高效表达的GST-RC7。经过洗涤、溶解（变性）、复性及纯化等处理,包涵体中GST-RC7得到溶解、复性和纯化。纯化的复性GST-RC7蛋白具有几丁质酶活性。对6种重要作物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明, RC7可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长,说明RC7可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。     

水稻10kD醇溶蛋白基因表达双元质粒的构建及其对烟草的遗传转化

将高含硫水稻１０ｋＤ醇溶蛋白基因从质粒ｐＦＭ１８亚克隆到植物高效表达载体卡盒ｐＲＳ１００中，得到双元表达质粒ｐＲＳ１０Ｋ；对其进行ＰＣＲ扩增及ＰＣＲ产物酶切分析，表明ｐＲＳ１０Ｋ包含来自ｐＲＳ１００的ｒｂｃＳ高效表达启动子、终止子和Ｍ１３通用引物互补序列及水稻１０ｋＤ醇溶蛋白基因。将ｐＲＳ１０Ｋ通过农杆菌感染法转化烟草，并对烟草转化植株进行ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果证明ｐＲＳ１０Ｋ的Ｒ     

具双价基因的甘蓝型油菜游离小孢子的遗传转化

以双低(低芥酶和低硫甙)甘蓝型油菜(Brassica napus)游离小孢子为受体，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，将几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因导入杂交油菜新品种油杂4号亲本恢复系和保持系中，成功地获得了转基因植株。在小孢子数与根癌农杆菌数接近时，100-200mg／L羧苄青霉素能有效地抑制菌的生长，而不影响小孢子胚胎形成。用预培养2d的小孢子与根癌农杆菌共培养10h后离心，重新悬浮小孢子于含上述浓度的羧苄青霉素的NLN培养基中培养，获得了16株抗卡那霉素的恢复系的单倍体植株。经PCR及PCR-Southern blot检测，有10株呈阳性，证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

粳稻云引抗稻瘟病基因的遗传分析及其定位

摘要：用8个稻瘟病菌[Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.]系对稻瘟病抗性材料云引进行田间注射接种鉴定。结果表明，云引对接种的8个菌系均表现为抗病反应。用抗病材料云引和感病材料丽江新团黑谷作亲本杂交获得F1，F1自交获得F2群体，用上述8个菌系分别对亲本、F1和F2群体进行田间注射接种，鉴定结果表明云引对所有8个菌系的抗性均表现为单基因控制的分离特性（抗感分离比为3∶1）。利用微卫星标记将云引对四川-43菌系的抗性基因初步定位于水稻的第11号染色体上，与标记RM202的遗传距离为3.8 cM。     

水稻OSNADK3基因的克隆及其遗传转化

从韩国浦项科技大学（Pohang University of Science and Technology,POSTECH）水稻T-DNA插入突变体库PFG_3A-04871.R株系中筛选到一个NADK3（NAD Kinase 3）激酶（LOC_Os05g32210）基因OSNADK3表达缺失的突变杂合体。与其野生型D...     

苹果sMdCAX1基因超表达载体的构建及遗传转化

为使sMdCAX1基因能在苹果中高效表达,改善苹果对Ca~(2+)吸收转运的能力,本研究构建了sMdCAX1植物超表达载体并将其通过农杆菌介导法转入长富6号苹果中。根据MdCAX1基因序列设计引物,从长富6号中克隆MdCAX1基因,通过PCR方法截除编码MdCAX1基因的N末端序列,获得sMdCAX1片段。利用重叠PCR方法将sMdCAX1序列中的SacI位点进行定点突变,并在序列两端分别添加BamHI和SacI酶切位点,获得长度为1272bp的突变序列sMd1+2Mu。利用BamHI和SacI双酶切sMd1+2Mu和植物表达载体pYH4215,目的片段经回收、连接、转化和筛选,获得植物双元表达载体pYH4215-sMd1,并将该载体转化农杆菌菌株EHA105。以长富6号无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化获得了转基因植株,经鉴定,有6个株系呈GUS染色阳性,其中2个株系呈PCR阳性。进一步对PCR鉴定阳性的株系进行RT-PCR分析,表明sMdCAX1基因在这2个株系中得到表达。本试验结果为进一步研究苹果MdCAX1基因的功能和通过转基因方法提高苹果果实钙含量奠定了基础。     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响。结果表明,选择无菌苗苗龄15d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3~0.6,侵染时间8min,侵染时菌体重悬液中添加50μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3d,抗性芽的获得率最高。对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

卡特兰ACO基因克隆与反义表达载体的构建

以卡特兰(Cattleya)花瓣为试材,提取其总RNA,并根据其他兰花的ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase, ACO)基因保守序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR法克隆得到1条967bp的卡特兰ACO cDNA片断,共编码321个氨基酸残基。序列分析结果显示该克隆片断与已发表的其他兰花的ACO基因序列同源性很高,均在85%以上,尤其与原生种和其近亲属的同源性在95%以上。将克隆的卡特兰ACO片段反向连接到植物表达载体pBI121中CaMV35S启动子的下游,构建了卡特兰ACO基因的反义表达载体pBI121ACC,为进一步应用反义技术培养长花期卡特兰新品种奠定了基础,也为首次应用生物技术延长卡特兰花期做出了尝试。     

水稻钙依赖型蛋白激酶0sCPK9基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

水稻钙依赖型蛋白激酶（CDPKs）是一个响应逆境胁迫并在植物发育过程中起重要作用的蛋白激酶。我们采用RT—PCR从水稻品种日本晴（Oryza sativa L．CV．Nipponbare）中克隆了OsCPK9基因靠近翻译起始位点下游的一段280bp的特异基因片段。将该片段以正、反向分别连接到来源于小麦TAK14基因的548bp内含子片段（NCBIaccessionnumber：AF325198）两侧,从而获得pSK．OsCPK9-RNAi的中间表达载体。进而将其克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1301中,构建shRNAi表达载体pCAMBIA．05CPK9一RNAi。经酶切和测序鉴定正确后,利用农杆菌介导转化水稻。通过抗性筛选和标记基因hyg和gus进行PCR鉴定,筛选到20株转基因水稻植株,实时荧光定量PCR分析显示,部分转基因植株OsCPK9的表达受到显著抑制。     

玉米Lc基因植物表达载体构建及菊花转化

Lc基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因，它在多种植物中的异源表达可以增加花青素的含量。本研究对pBI121载体Gus基因后的终止子进行2次PCR扩增，在原Sac I酶切位点后添加了新的Sac I酶切位点，利用组织化学染色法检测，结果表明改造后的载体上的Gus基因能正常表达，终止子功能正常，载体改造成功。用改造的pBI121N构建了含有Lc基因的植物表达载体pBI121N-Lc，利用农杆菌介导法转化菊花叶盘，获得了19株生根抗性苗。通过提取抗性苗基因组总DNA，PCR扩增Lc基因和CaMv35S启动子获得了11个阳性株系，PCR结果表明Lc基因已经转入菊花中。同时，在己获得的转基因植株中发现7个株系的根系有变红的现象。     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。     

大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其在烟草上的转化研究

为解决杂交大豆(Glycinemax)制种过程中不育系易与保持系混杂的问题,开展了大豆叶绿体转基因的研究。通过转基因方法在不育系的细胞质中植入筛选标记基因,以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列(GenBankX07675)设计引物,用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR,克隆到质粒pUC19中,并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间,以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3′序列,分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上,将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上,得到pJY03与pJY04,并初步应用于烟草(Nicotianatobacum)的叶绿体转化,获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗,PCR扩增出aadA基因的条带,并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达。