口蹄疫病毒3ABC基因遗传关系分析

参考GenBank中发表的猪源O型口蹄疫病毒3ABC的基因序列。设计一对特异引物,分别以5株猪源O型FMDV流行毒株基因组RNA为模板。通过RT-PCR的方法获得3ABC基因,并克隆到pMD18-T载体中。测序结果显示,5株O型FMDV流行毒株的3ABC基因cDNA均为1281bp。编码由427个氨基酸残基组成的多肽。同源性比较和系统发育树分析表明,5株O型FMDV流行毒株亲缘关系密切,属同一基因型。     

口蹄疫病毒3ABC基因的扩增与序列分析

参考GenBank中发表的猪源O型口蹄疫病毒(FMDV)3ABC的基因序列,设计一对特异引物,分别以5株猪源O型FMDV流行毒株基因组RNA为模板,通过RT-PCR的方法获得3ABC基因,并克隆到pMD18-T载体中.测序结果显示:5株O型FMDV流行毒株的3ABC基因cDNA均为1 281bp,编码由427个氨基酸残基组成的多肽.同源性比较和系统发育树分析表明:5株O型FMDV流行毒株亲缘关系密切,属同一基因型.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达

从感染口蹄疫病毒 (foot- and- m outh disease virus,FMDV)的细胞中提取总 RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)获得了长度约为 14 0 0 bp的核酸片段 ,与预期长度相符。扩增产物经克隆后 ,测序证明其含有完整的 3ABC基因。该序列与国外参考序列 0 1K/ 6 6相比 ,同源性在 99%以上。亚克隆 3ABC基因至表达载体 p Tri Ex- 4 Neo中 ,通过序列分析发现 ,克隆到 p Tri Ex- 4 Neo载体上的片段于 3ABC基因 70 9～ 72 5 bp之间有 17bp的缺失 ,碰巧在 3AB基因后形成一终止密码子 ,但 3AB基因的阅读框架完整。选出含有 3AB基因完整阅读框架的阳性克隆 ,用 IPTG诱导表达 ,收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western blotting分析 ,结果表明 ,3AB基因在大肠杆菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 33.5 ku的融合蛋白 ,并能被口蹄疫病毒阳性血清识别。经薄层扫描分析 ,表达的目的蛋白占总蛋白量的 2 6 %以上。该项研究为应用重组 FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫的鉴别诊断方法提供了依据     

口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China／99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59．1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31．4％。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV3ABC基因，将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SaⅡ酶消化后，克隆到表达载体pGEX-6p-1上，构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）pLysS，经终浓度1mmol／L的IPTG诱导，获得约70ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示，表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GsT-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较，表明，融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。     

口蹄疫3ABC蛋白基因的克隆与序列分析的研究

采用RT—PCR扩增FMDV的3ABC蛋白DNA，将其与pUCm—T栽体连接，构建pUCm—3ABC重组质粒，序列分析表明，pUCm—3ABC重组质粒的插入DNA与多种血清型FMDV的相同DNA区段有较高的同源性，提示可进一步用pUCm—3ABC重组质粒研究FMDV3ABC蛋白的表达抗原。     

口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达

将O型口蹄疫病毒Akesu／58株适应细胞培养。用RT—PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白（PEGFPNl）栽体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希茵增殖。提取PEGFPN1—3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。     

禽流感病毒HA基因的分子克隆和测序

血凝素（HA）是禽流感病毒诱导机体产生保护性体液免疫反应的主要靶抗原。本研究的目的是克隆HA基因，为以后的表达及基因工程疫苗的研制奠定基础。收获接毒鸡胚的尿囊液，超速离心沉淀病毒，采用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，利用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术扩增出禽流感病毒（H9N2亚型）血凝素的cDNA。PCR产物加A尾后，用玻璃奶试剂盒回收纯化目的片段，通过T－A连接将加尾PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-T easy vector，转化DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定，对目的片段进行测序，结果获得了HA基因全长，约1．7kb，与已知序列进行同源性比较，同源性最高的可达97％，所克隆的基因为禽流感HA基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV-L1和FMDV-L2的RNA，用1对通用引物经RT-PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段，将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM-T Easy中，转入大肠埃希氏菌JM109，得到大量携带目的基因的质粒；经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列；利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV—L1和FMDV-L2以及作为参考毒株的A22／India／17／77进行序列分析。结果表明，核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列，氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG-βH环内，其中毒株FMDV-L1和FMDV-L2 RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异，分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

3株O型FMDV VP1基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的O型口蹄疫病毒(FMDV)(分别命名F1、F2、F3)为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计2对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的cD-NA片段,将3个cDNA片段分别克隆到pMD20-T Vector载体中进行序列测定,得到3个毒株VP1基因的序列。结果表明,3个O型FMDV毒株VP1基因cDNA长度均为639 bp,编码213个氨基酸。3株O型毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在92.3%~94.2%之间,推导氨基酸序列同源性在97.2%~98.6%之间。与3个毒株同源性高的主要为香港和台湾的毒株。     

口蹄疫病毒VP1基因的克隆及结构蛋白VP1的原核表达

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒VP1基因的引物，用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD—P1中扩增得到目的基因VP1（639bp）。用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体．转化宿主菌BL21（DE3），经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆．测序证明目的基因正确插入了表达载体，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS—PAGE电泳，Westerll—blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1结构蛋白在大肠杆菌中表达量较高，表达产物的分子量约为41Ku，并能被口蹄疫阳性血清所识别，经分析表达蛋白约占菌体蛋白的34％。口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有免疫原性。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达载体构建

用Trizol提取O型口蹄疫病毒RNA,根据已经公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对VP1基因的引物,通过RT-PCR扩增出VP1基因,将其克隆至表达载体pET-32a中。经测序表明,目的基因VP1已正确地整合至表达质粒中。     

不同ELISA试剂盒检测感染猪口蹄疫病毒3ABC抗体效果比较

为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

鸡贫血病毒vp3基因克隆、序列分析和比较

克隆了从我国哈尔滨分离的一株鸡贫血病毒（CAV）的vp3基因，并对之进行了测序。该基因的开放读码枢由366bp组成，编码121个氨基酸，氨基酸组成具有已报道VP3的典型特点。本次克隆的基因与GenBank收录的CAV的vp3基因进行序列比较，同源性至少为98％。与国内报道的山东株SJ1的vp3基因有3个核苷酸的差异，表明国内的CAV毒株已经产生了一些分化。在EMBL中比较本次克隆的VP3蛋白一级结构，与之差异最大的是马来西亚分离株的VP3，有5个氨基酸残基不同，同源性为96％。同时收集EMBL中的CAV的VP3蛋白绘制进化树，我国哈尔滨分离的CAV毒株与CIA进化关系最近，而与Cux-1的2个衍生株QDWX1、QDWX3进化关系最远。这些结果进一步证明了CAV在遗传方面是较保守的病毒，来自哈尔滨的CAV不是CAV的一个独立分支。     

牛副流感病毒3型N基因的克隆与系统进化分析

扩增大庆地区分离的牛副流感病毒3型的N基因,并进行同源性分析。设计特异性引物,通过聚合酶链反应扩增牛副流感3型N基因,将该基因分别连接到克隆载体的BamHⅠ、HindⅢ酶切位点中,测定插入片段的核苷酸序列,并利用分子生物学软件进行同源性分析。序列分析结果表明,扩增获得BPIV-3-N基因全长1 548bp,编码515个氨基酸,该N段基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GenBank中日本分离株910N基因序列同源性较高,核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为100%。