转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性

【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记,研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化,采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同,均为长椭圆形,近杆状,整个细胞呈现绿色荧光,PCR结果表明,从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期,荧光素酶活性快速增加,到稳定期,荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次,仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光,荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致,在番茄组培苗内的侵染路线相同,致病力均达到90%以上。【结论】将gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌,融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。     

青枯雷尔氏菌脂肪酸型与致病性的关系

 【目的】分析青枯雷尔氏菌脂肪酸种类变化与致病性指标-弱化指数和回接发病率的相互关系,提出青枯雷尔氏菌脂肪酸型种下分化的分类方法。【方法】青枯雷尔氏菌脂肪酸型分为：脂肪酸Ⅰ型,弱化指数＞0.8,回接发病率0%,属无致病力型;脂肪酸Ⅱ型,弱化指数为0.6～0.8,回接发病率为6.7%～100%,属过渡型,脂肪酸Ⅲ型,弱化指数＜0.6,回接发病率100%,属强致病力型。利用聚类分析、主成分分析、判别分析,分层筛选与脂肪酸型有关的脂肪酸种类.【结果】筛选出十四碳脂肪酸（X1）、十七碳脂肪酸（X9）,十八碳脂肪酸（X13）为主要因子,组建数据矩阵,建立脂肪酸型判别模型：Y1=-16.3353 + 0.0012X1 + 0.0056X9 - 0.0016X13,Y2= -3.4928 + 0.0002X1 + 0.0003X9 + 0.0025X13,Y3= -9.1550 - 0.0003X1 + 0.0039X9 + 0.0042X13,对于一个未知脂肪酸型的青枯雷尔氏菌菌株,首先测定脂肪酸图谱,取出X1（十四碳脂肪酸）、X9（十七碳脂肪酸）、X13（十八碳脂肪酸）,代入方程,计算Yi,当1≤Yi≤2时,归为脂肪酸型Ⅰ,当2≤Yi≤3时,归为脂肪酸型Ⅱ,当Yi＞3时,归为脂肪酸型Ⅲ,模型的判别准确率达90.00%。【结论】青枯雷尔氏菌脂肪酸型的研究,为其种下分化建模的标准化和计算机自动分析方法的建立,提供可靠的基础。脂肪酸型的模型建立也为其他植物病原菌的致病性研究提供了思路和方法。     

福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究

 【目的】利用气相色谱技术检测福建省的40株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分化方法之间的关系。【方法】对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行气相色谱分析，比较同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌脂肪酸的分布；对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行聚类分析，分析聚成的各类青枯雷尔氏菌脂肪酸的特点以及脂肪酸多态性与其生理小种、生化型和致病性之间的关系。【结果】同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；对40株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成3类，即group Ⅰ、group Ⅱ和group Ⅲ；青枯雷尔氏菌生理小种1存在着不同的脂肪酸类群，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病性之间存在一定的相关性：group Ⅰ为无致病性菌株，group Ⅱ为过渡性菌株，group Ⅲ为强致病性菌株。【结论】福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸分布存在着明显的多态性；青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在一定的相关性，脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。     

青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法的研究

采用不同浓度的强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91处理番茄盆栽苗,建立青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法.结合菌落形态和特异性引物鉴定结果说明所分离得到的菌株均为强致病力青枯雷尔氏菌.当番茄植株培养至第5d时,4个不同接种浓度处理的番茄植株苗均出现发病症状.采用104 cfu·mL-1处理的番茄植株在第4d发病,但到第8d,...     

青枯雷尔氏菌致病性的代谢组学异质性研究

采用基于LC/Q-TOF MS的代谢组学方法,对不同致病性青枯雷尔氏菌的胞外代谢物进行了分析,获得了具有显著性差异的代谢标志物,并采用PCA数据处理方法对不同致病性菌株进行分类,建立致病性的PLS-DA预测模型。结果表明,该方法可以从代谢水平上区分野生型强致病力菌株、野生型无致病力菌株以及强致病力菌株经Tn-5转座子插入导致致病力丧失的人工致弱突变菌株。对代谢标志物的差异分析结果表明,在无致病力菌株和Tn-5致弱菌株中,有12种代谢标志物与强致病力菌株具有显著性差异(P<0.05,FC≥2),并表现出相同的丰度变化趋势,预示着这些代谢标志物可能与青枯雷尔氏菌的致病性有关。     

拮抗青枯雷尔氏菌的放线菌筛选及其防病作用

【目的】青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草的主要病害。本研究从不同生境的土壤中筛选出对青枯雷尔氏菌有较强拮抗作用的放线菌,探究其对青枯雷尔氏菌的生理特征影响以及对烟草青枯病的防治效果,为进一步开发防病微生物菌剂提供理论依据。【方法】利用共培养法和牛津杯法筛出目标放线菌后,通过形态学研究、生理生化试验和多基因系统发育分析对目标菌株进行菌种鉴定。通过96孔板法测定目标放线菌粗浸膏对青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度(MIC)。粗浸膏对青枯雷尔氏菌处理后,检测青枯雷尔氏菌的生长动态变化,并用扫描电子显微镜观察其形态的变化;通过测定β-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶(PI)荧光试验以及傅里叶变换红外光谱观察对细胞膜通透性和膜成分的影响;通过测定胞外多糖(EPS)、胞内活性氧(ROS)等探究目标放线菌株对青枯雷尔氏菌的影响。并通过盆栽试验测定目标放线菌株对烟草青枯病的防治效果。【结果】根据形态特征、生理生化试验结果和测序结果,将筛选得到的目标放线菌Sa-21菌株鉴定为雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus),对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径达47...     

茄子3株内生细菌分别与青枯雷尔氏菌混合培养特性研究

采用混合培养的方法,研究3株茄子内生细菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,FJAT-943)、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis,FJAT-946)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus,FJAT-964)与青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,FJAT-1305)数量消长动态。筛选优化培养基配方为:葡萄糖5g.L-1,酵母膏5g.L-1,蛋白胨10g.L-1。混合培养条件下,各菌株生长数量均低于单独培养。菌株FJAT-943和菌株FJAT-1305混合培养体系中,菌株FJAT-1305不能生长;菌株FJAT-946与菌株FJAT-1305混合培养3d,菌株FJAT-1305生长数量为7.40×109 cfu.mL-1,显著低于单独培养的9.78×109 cfu.mL-1;菌株FJAT-964与菌株FJAT-1305混合体系中,生长数量与单独培养均无显著差异。菌株FJAT-943、FJAT-946对菌株FJAT-1305具有显著抑制作用。     

一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20 μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体增殖液中的噬菌体核酸进行琼脂糖凝胶电泳,确定其基因组片段大小;最后用常规方法测定噬菌体的滴度、最佳感染复数、一步生长曲线,并通过比较加入噬菌体液前后青枯雷尔氏菌菌液的OD₆₀₀值变化测定其对温度、pH、紫外线、氯仿的敏感性。【结果】分离并纯化出了一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体,命名为∈RS-1, 噬菌斑为圆形,清晰透明,边缘光滑,直径1-2 mm,经电镜观察其形态为蝌蚪状,头部为二十面体的立体对称,直径约为94 nm,并有一带伸缩尾鞘的长尾大约为27 nm×100 nm,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目（Caudovirales）,肌尾噬菌体科(Myoviridae)的裂解性噬菌体,核酸性质为dsDNA;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析至少可以观察到25条蛋白条带,相对分子质量在10-100 kD,说明其蛋白外壳至少含有25个结构蛋白;将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示其条带大于48 kb,符合肌尾噬菌体科基因组大小范围（31-317 kb）;生物学特性的测定显示该噬菌体对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数为0.01;其吸附和感染青枯雷尔氏菌时的潜伏期约为30 min,爆发期约为80 min,裂解量约为156;该噬菌体的裂解活性在28℃时最高,在28-50℃均较强,但在温度超过60℃后活性基本丧失;其对酸碱的耐受力较强,在pH 3-8的范围内均有较强的裂解活性,当pH值超过9后活性开始降低;其对紫外线有一定的耐受能力,经紫外线照射0-9 min后裂解活性依然较强,12 min后活性开始下降,21 min后活性基本丧失;其对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。【结论】分离到了裂解性的青枯雷尔氏菌噬菌体,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,经过测定其各项生物学特性可知其潜伏期较短,裂解能力较强,具有很好的杀菌效果,且其裂解活性持续时间长,并能在不同温度、不同酸碱性的环境内有较强的适应能力,具有开发为抗青枯雷尔氏菌菌剂的潜力。     

不同致病性青枯雷尔氏菌诱导番茄代谢产物的异质性研究

采用基于气相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法 ,研究不同致病性青枯雷尔氏菌诱导番茄植株代谢物变化的异质性。将青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91和无致病力菌株FJAT-1458分别单独接种和混合接种番茄植株,以清水为对照,接种后6、24、48、72、96h取样,测定番茄植株代谢产物的变化。结果表明,检测到的代谢物种类主要为醇类、酯类、酸类、醛类、吡啶类和烷烃类。不同处理番茄代谢产物组成变化的时间动态结果表明,FJAT-91单独接种处理48h、FJAT-1458单独接种处理48h、同时接种FJAT-91和FJAT-1458处理96h及对照处理72、96h的番茄中检测到代谢物种类最多,分别为12、18、15和15种。邻苯二甲酸二丁酯在不同处理不同时间的番茄中均检测到,为完全分布类型,其他代谢物为不完全分布类型。FJAT-91单独接种处理能诱导番茄代谢产物棕榈酸消亡,而FJAT-1458单独接种或与菌株FJAT-91混合接种及对照处理的番茄植株该代谢物维持在相当含量,说明该代谢物可能与植株免疫抗病有关。主成分分析表明,不同接种处理诱导番茄植株的代谢谱存在一定的差异,主成分一和主成分二基本上能将其区分开来。     

4种植物叶提取液对青枯雷尔氏菌抑菌活性研究

青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum是一种毁灭性土传病害病原菌,防治困难,通过抑菌圈、抑菌率、最小抑菌浓度测定,探讨羊蹄甲、三裂蟛蜞菊、马缨丹、芒果叶提取液对青枯菌的抑制效果。结果表明：三裂蟛蜞菊叶提取液的抑菌效果最好,抑菌圈范围为15.00～18.13 mm,为高度敏感,在0.40 g·mL^-1浓度处理下,其抑菌率达到79.63%,显著高于其他处理组;羊蹄甲和马缨丹叶提取液的抑菌圈范围为10.67～15.57 mm,为中度敏感,抑菌率分别为58.33%和60.37%;芒果叶提取液的抑菌效果最差。     

烟草青枯病菌噬菌体分离及其生物学特性研究

【目的】烟草青枯病是我国南方烟区发生普遍而严重的细菌病害,目前尚未有理想的化学防治药剂,筛选青枯病菌噬菌体,为作物青枯病的防治提供噬菌体资源。【方法】从江西省吉安市烟田采集土壤样本,采用双层平板培养分离方法,分离青枯菌噬菌体,进一步比较物理和化学因素对噬菌体活性的影响。【结果】从吉安烟田土壤中分离获得6个青枯菌噬菌体,编号为PTb7-1、PTb1521、PTb1553、P1Tb1556、P2Tb1556和PTb574,其生物学特性存在差异。结果显示,多个噬菌体的最适生长温度约为35℃,致死温度为55～60℃,适宜酸碱度为pH 5～9,且对紫外光、乙醚和氯仿敏感。然而,噬菌体PTb7-1只适合于酸性环境条件下生长繁殖,噬菌体P2Tb1556对紫外光和乙醚不敏感,但对氯仿敏感。【结论】烟草土壤中具有丰富的青枯菌噬菌体资源,是筛选噬菌体的材料来源。6个青枯菌噬菌体生物学特性存在差异,噬菌体P2Tb1556对紫外光和乙醚不敏感,但对氯仿敏感。     

青枯雷尔氏菌在芝麻植株内的分布及消长动态

芝麻青枯病是我国南方芝麻生产上的重要土传病害。通过测定健康植株、不同发病时期的自然病株及人工接种病株内不同部位青枯雷尔氏菌数量,旨在明确病菌在芝麻植株内的分布及消长动态。结果表明:发病初期,病株内青枯雷尔氏菌总数量随着病情的发展而增加,之后随着病情严重度的加重而下降。病菌的致病力则随着病情发展呈现持续上升的趋势。检测的所有芝麻健株各部位均无青枯雷尔氏菌分布,说明芝麻植株不存在无症状侵染现象。青枯雷尔氏菌在芝麻病株内的分布呈现丰富的多态性,自然病圃和灌根接种的Ⅱ类、Ⅲ类病株各部位菌量分布随着植株高度的升高而递减,但其Ⅰ类病株中下部菌量却高于基部。针刺接种的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类病株,接种点以下的根部和基部均有青枯雷尔氏菌分布,说明青枯雷尔氏菌不仅可随植物蒸腾向上扩散,也可向下蔓延。     

青枯雷尔氏菌TN5转座子无致病力突变株插入位点的鉴定与分析

利用TN5插入强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91,获得突变株FJAT-t582和FJAT-t583。菌落形态观察及弱化指数测定结果表明,突变株FJAT-t582和FJAT-t583表现为典型的无致病力菌落形态,且弱化指数均在0.8以上。利用卡那霉素抗性基因特异性引物从突变菌株FJAT-t582和FJAT-t583中均扩增出片段大小为681bp的条带,而野生型菌株FJAT-91未扩增出任何条带,说明TN5转座子已插入其基因组中。对这2株无致病力突变株进行反向PCR测序和序列比对,分析鉴定出插入位点在编码putative diguanylate phosphodiesterase基因和Ⅲ型效应蛋白基因中,推测这2个基因的突变致使强致病力菌株表现出无致病力特征。     

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株的异质性

【目的】研究青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）Tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标“弱化指数（attenuation index,AI）”和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数（chromatography titer index, CTI_i）,CTI_i=S_i/（S₁+S₂+S₃）×100%（i=1、2或3;S₁、S₂和S₃分别对应P₁、P₂和P₃的峰面积）,测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTI_i值,用皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient,PCC）分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果,青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型：强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株,其AI值介于0.49-0.63,接种番茄15 d,植株发病率为66.33%-100%;无致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78-0.89,接种番茄15 d,植株发病率为0;中间型菌株共有7株,其AI值介于0.68-0.73,接种番茄15 d,植株发病率为24.17%-45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示,防治效果介于16.68%-92.45%,菌株T831防治效果最好,达91.74%,其次是菌株T780,防治效果为87.51%,菌株T497防治效果最差,为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示,青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P₁（出峰时间为0.6 min）、P₂（出峰时间为4.4或4.5 min）和P₃峰（出峰时间为5.9或6.0 min）;强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型：单峰、双峰和3个峰,强致病力菌株的主峰为P₃峰,无致病力菌株的主峰为P₁峰,中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型;强致病力菌株中CTI₃为100%的菌株,致病力最强,诱导番茄植株发病率均达85%以上,CTI₃＜100%的菌株,接种后番茄植株发病率介于66.33%-84.14%;无致病力菌株中CTI₁达100%的菌株,其防治效果高,均达到80%以上,CTI₁＜90%的菌株,其防治效果低,介于16.68%-63.62%;CTI₃与突变菌株致病力呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.62;CTI₁与无致病力突变菌株的防治效果呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.80。【结论】青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型,不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI₁可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株,CTI₃可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。     

利用无致病力青枯菌株防治番茄青枯病的研究

自发突变的无致病力番茄青枯菌株Ｔｍ３具有产生细菌素的能力,对番茄青枯菌株Ｔｍ４６有较强的抑菌作用,且能诱导烟草植株产生过敏性反应。盆栽和小区试验结果表明,Ｔｍ３具有较好的防治番茄青枯病的能力。防病机理可能是细菌素的抗生素和诱导植物抗病性的双重作用。     

芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

将采自江西12个县(市)的芝麻青枯雷尔氏菌29株菌株分别人工接种到寄主植物番茄、茄子、马铃薯和烟草上,鉴定结果表明:全部菌株属于生理小种1;25株菌株属生化变种Ⅲ,3株属生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅲ-1亚种。对致病力测定结果的聚类分析表明:来自进贤、都昌、南昌、樟树4个红壤旱地传统种植区的菌株致病力最强;来自鄱阳砂壤及潮洲地传统种植区的菌株致病力中等;来自其它6个区域的菌株致病力最弱。因此,江西芝麻青枯雷尔氏菌的致病力存在明显的分化现象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的重要因子。     

芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

将采自江西12个县(市)的芝麻青枯雷尔氏菌29株菌株分别人工接种到寄主植物番茄、茄子、马铃薯和烟草上,鉴定结果表明:全部菌株属于生理小种1;25株菌株属生化变种Ⅲ,3株属生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅲ-1亚种。对致病力测定结果的聚类分析表明:来自进贤、都昌、南昌、樟树4个红壤旱地传统种植区的菌株致病力最强;来自鄱阳砂壤及潮洲地传统种植区的菌株致病力中等;来自其它6个区域的菌株致病力最弱。因此,江西芝麻青枯雷尔氏菌的致病力存在明显的分化现象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的重要因子。     

60Coγ-射线对当归杀虫效果研究

对当归的主要仓贮虫害进行了调查,并开展了辐射杀虫效果和辐射后当归中主要药用成分分析的研究.虫害调查结果表明当归的主要害虫是烟草甲.在对烟草甲进行辐射致死效应研究中,试验所用材料为烟草甲成虫和其越冬末龄幼虫.通过对辐射致死剂量和致死剂量率的研究,结果表明在剂量率为0.3KGy/min时,1.2KGv辐射15天后能100%杀灭成虫,幼虫死亡率也达82.61%,且60天后该剂量处理的幼虫全部死亡;当剂量为1.0KGy时,剂量率为0.45KGy/min的辐射处理,2周后成虫死亡率达80%,4周后全部死亡.生化分析表明经1.5KGy～6.0KGy辐射后,当归中主要药用成分阿魏酸含量无明显变化.