小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。     

小麦冷休克蛋白基因TaCSP的克隆及表达分析

为深入研究小麦冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)基因,根据大肠杆菌(E.coli)CSPs蛋白保守氨基酸序列,借助生物信息学技术检索小麦EST序列,采用同源序列法拼接了小麦3个冷休克蛋白基因,并以小麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR对其进行扩增;同时,采用荧光定量PCR对3个基因的组织表达特性以及ABA、低温、高温、干旱和盐胁迫条件下的表达模式进行了研究。结果表明,小麦3个冷休克蛋白基因TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3全长分别为290、374和377bp,各编码69、69、80个氨基酸残基。序列分析表明,TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3之间氨基酸相似性为72.9%~84.3%,与大肠杆菌来源CSPs的相似性为40.0%~79.7%。荧光定量PCR表达谱分析显示,TaCSPs在抽穗期小麦的根、茎、叶和幼穗中均能表达。胁迫分析表明,3个冷休克蛋白基因在小麦幼根中的表达,在低温和ABA处理下,表现为早期诱导、后期抑制,在高温、干旱和盐胁迫下,则表现为早期抑制、后期有所恢复。克隆获得的小麦3个冷休克蛋白基因在根组织中强烈表达,并受ABA和冷胁迫诱导,推测其在小麦抵御逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦G6PDH基因家族的鉴定与表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径中的关键限速酶,在植物生长发育及非生物胁迫响应中发挥重要作用。本研究利用生物信息学对小麦 G6PDH基因家族成员进行鉴定,并对该家族基因编码蛋白的理化性质、进化关系、亚细胞定位、基因复制事件以及在不同组织和不同胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,在小麦基因组中共鉴定到14个 G6PDH基因家族成员,分布在小麦2A、2B、2D、4A、4B、4D、6A、6B和6D染色体上,其中5个基因编码的蛋白为胞质型,9个为质体型。亚细胞定位预测表明,胞质型G6PDH蛋白主要定位于细胞质上,而质体型G6PDH蛋白主要定位于叶绿体上。根据系统进化和保守结构域特征,可将14个小麦G6PDH蛋白分为Cy、P0、P1和P2四个亚组。共线性分析表明,小麦 G6PDH基因家族成员存在17对片段重复基因。RNA-seq分析结果表明,小麦 G6PDH基因家族成员在不同组织中存在明显的表达差异,其中 TaG6PDH1-2A/2B/2D基因在根中的表达量最高; TaG6PDH2-2A和 TaG6PDH2-2B基因在干旱胁迫后1 h以及热胁迫后6 h均上调表达。进一步利用qRT-PCR检测6个小麦 G6PDH基因在干旱和盐胁迫下的表达模式,发现分别有5个基因在小麦根中均上调表达,推测小麦 G6PDH基因在非生物胁迫响应过程中发挥着重要功能。     

小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究 TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了 TaCP3基因,该基因仅含1个1125 bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明, TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40 kD。qRT-PCR结果表明, TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。     

小麦品种东农冬麦2号根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表达特性分析

膨胀素(expansin)是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的蛋白,包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四个基因家族,对植物根系的形成及快速发育具有重要作用。本试验以寒地冬小麦品种东农冬麦2号两叶一心期的根为材料,克隆了TaEXPA7基因的3个CDS全长,其氨基酸序列同源性较高,仅信号肽处有两个氨基酸不同,其核酸序列长度均为777bp,编码258个氨基酸,分别命名为TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D,且分别定位于2AL、2BL、2DL染色体。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1两个保守结构域,分子量为27 670.74Da,等电点为8.09,均为疏水性蛋白;与节节麦、二穗短柄草的相似性分别为99%和92%。采用两叶一心期的根进行qRT-PCR分析发现,TaEXPA7-A/B/D三个基因在根尖中的表达量均较高,伸长区和成熟区次之;对冬小麦根进行低温、干旱和激素处理后,这三个基因均下调表达,并且TaEXPA7-B基因的相对表达量较高,TaEXPA7-D的相对表达量较低。由此可见,多倍体小麦不同染色体上的基因在应对不同环境胁迫时,表达以及应答模式存在差异,并且在不同的环境胁迫下,发挥主导作用的染色体也存在差异;此外,该基因在根中的表达可能与低温、干旱以及外源激素的胁迫有一定的关系,可能是促进根系生长的重要基因。     

小麦TCP基因家族的全基因组鉴定和对热胁迫的响应

TCP是植物发育调控的重要转录因子。为了挖掘小麦TCP基因的功能,本研究利用生物信息学方法和qRT-PCR技术,对小麦TCP基因家族进行全基因组鉴定和在热胁迫下的表达分析。全基因组鉴定结果表明,普通小麦品种中国春中存在58个非冗余的TaTCP基因。根据与AtTCPs和OsTCPs的系统发育分析,在小麦中分别有26个PCF、20个CIN和12个CYC/TB1聚类。进一步预测TaTCP基因在达尔文进化下的压力选择,发现除了TaTCP16-A相对于乌拉尔图小麦中直系同源基因是正向选择,其他基因都是纯化选择的过程。利用在线RNA-seq数据分析TaTCPs基因在5种组织器官中与冷、热和干旱胁迫下的表达图谱,结果显示,小麦TCP基因在不同的组织和胁迫中存在差异表达。最后,通过qRT-PCR技术检测12个不同发育阶段的小麦叶片在短期热胁迫下TaTCP5部分同源基因的表达水平,结果表明,在35℃下处理1h,TaTCP5-D的相对表达量在拔节期、拔节后期、孕穗前期和抽穗期都有明显的上调,这些结果为进一步研究TaTCP基因的功能奠定了良好的基础。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

六倍体小麦CBS基因家族全基因组分析

Cystathionineβ-synthase(CBS)基因家族在植物生长发育以及响应胁迫过程中具有重要作用,目前对CBS基因家族的研究报道较少。异源六倍体普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD)作为重要的粮食作物,其CBS基因尚未得到系统研究。为研究小麦中CBS基因的特征,本研究对小麦全基因组进行了分析,共发现136个属于32个同源组的CBS基因,系统发育树分析将其分为8组。将这些基因定位于小麦染色体上,并对它们的基因结构、保守基序以及结构域做进一步分析,发现三联体中的CBS结构域蛋白(CDCP)具有相似的结构。在不同温度下,大多数CBS基因的三联体具有相似的表达模式。在低温及冻害条件下CBS基因在小麦抗寒过程中发挥重要作用。     

小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因（ TaAGT2）的克隆、生物信息学预测及表达分析

光呼吸是植物细胞H_2O_2的重要来源,也是维持细胞氧化还原的重要成分,影响植物对生物和非生物逆境的应答,因此,挖掘与光呼吸有关的基因对提高植物的抗逆性具有重要意义。本研究以耐旱小麦品种青麦6号转录组数据为基础,通过RACE技术克隆得到小麦 AGT2基因的全长cDNA,将其命名为 TaAGT2,并对其进行了生物信息学预测及表达模式分析。结果表明, TaAGT2开放阅读框长1 434bp,编码477个氨基酸。该蛋白属于亲水性稳定蛋白,定位于线粒体中,二级结构以α-螺旋(42.14%)和无规则卷曲(32.91%)为主。 TaAGT2基因包含AAT-I基因族保守区域,与二穗短柄草 AGT2的相似性高达97%。通过qRT-PCR对基因 TaAGT2在不同组织中(根、茎和叶)及4种非生物胁迫(低温、ABA、干旱、高盐)下的表达特性进行分析,结果表明, TaAGT2在根、茎和叶中均有表达,茎中的表达显著高于根和叶,在不同胁迫条件下上调表达,表明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦microRNA167e的特征及表达模式分析

MicroRNAs(miRNAs)是一类在植物发育调控和逆境胁迫响应过程中发挥重要功能的小RNA,为了探讨miR167e在小麦中的生物学功能,以小麦品种中国春、豫麦18和矮抗58为材料,利用RT-PCR技术克隆了小麦miR167家族基因新成员 MIR167e,并采用qRT-PCR技术分析了其时空表达特性及其对渗透胁迫的响应模式。结果将小麦 MIR167e基因定位在第5同源群染色体的短臂上,将该基因A、B和D基因组的三个部分同源基因分别命名为 TaMIR167e-5AS、 TaMIR167e-5BS和 TaMIR167e-5DS。序列分析显示,该miRNA前体区域在所检测品种间高度保守,3个部分同源基因间仅存在SNP差异,在成熟tae-miR167e对应区域完全一致。时空表达特性分析显示,tae-miR167e在籽粒发育过程中表达呈上调趋势,在不同组织间的表达差异较大,其中在3叶期,叶片和根系中表达量较高,种子中次之,穗下节中表达量最低;在干旱胁迫条件下,该miRNA受胁迫诱导而上调表达,与中国春相比,矮抗58根系中该miRNA的诱导表达启动更快,在叶片中的表达水平更高;在盐胁迫条件下,该miRNA在根系中呈下调表达趋势,而在叶片中上调表达。推测tae-miR167e在小麦发育调控和渗透胁迫响应过程中发挥重要功能。     

粗山羊草JAZ基因家族的全基因组鉴定与分析

为了挖掘可用于小麦茉莉酸调控通路及其穗部或花器官发育研究的候选基因,基于已发布的粗山羊草全基因组数据,利用生物信息学分析方法鉴定了粗山羊草JAZ基因家族,并从染色体分布、基因及蛋白结构、启动子顺式作用元件、系统进化关系和基因表达模式等方面对该基因家族的特征进行了比较分析。结果表明,本研究共鉴定到9个粗山羊JAZ基因,命名为AetJAZ1-AetJAZ9。染色体定位结果显示,9个粗山羊草JAZ基因分别定位在2D、5D、6D和7D染色体上,其中在7D染色体上分布最多。进化分析表明,粗山羊草JAZ蛋白与短柄草JAZ蛋白亲缘关系最近,且9个粗山羊草JAZ蛋白被分别聚类到了S5、S12、S13、S16和S20五个亚族中,其中S20亚族有五个粗山羊草JAZ蛋白。启动子分析表明,9个粗山羊草JAZ基因启动子顺式作用元件种类和数量存在差异,推测其各自的功能也存在差异。表达谱分析表明,粗山羊草JAZ基因在粗山羊草不同组织间存在不同的表达特性,且不存在组成型表达基因,其中,AetJAZ1和AetJAZ2表现出明显的组织特异性,分别只在穗部、雌蕊和雄蕊中特异表达。     

小麦EPF/EPFL基因家族的全基因组鉴定及 TaEPF1-2B与气孔性状的关系分析

表皮模式因子EPF/EPFL基因家族编码一类植物中特有的分泌类蛋白,在植物生长发育特别是形态建成过程中发挥着重要作用。为挖掘和利用小麦EPF/EPFL家族基因,对小麦该家族基因进行了系统鉴定,并利用生物信息学技术对其基因结构、蛋白质结构域、系统进化及表达特性进行分析。结果表明,在小麦全基因组水平共鉴定到35个TaEPF/EPFL基因家族成员,含有1~4个外显子,分布在除1A、5B外的19条染色体上,全基因组复制事件是导致该基因家族扩张的主要原因。蛋白结构分析显示,其编码蛋白的C端包含6个相对保守的半胱氨酸残基,N端存在信号肽剪切位点,且亚细胞定位在胞外基质中,属于一类胞外分泌蛋白。系统进化分析发现,TaEPF/EPFL基因在单子叶和双子叶植物分化之前就已形成。表达模式分析发现,大多数TaEPF/EPFL基因在小麦幼嫩组织和穗部表达量较高,部分TaEPF/EPFL基因响应干旱、高温等非生物胁迫。进一步分析 TaEPF1-2B不同单倍型与气孔性状的相关性,发现TaEPF1-2B不同单倍型的气孔密度、气孔长度、气孔宽度和气孔面积均存在极显著差异,净光合速率存在显著差异,其中单倍型Hap A具有较低的气孔密度和较高的光合速率,是优势单倍型。本研究结果为进一步改良小麦的抗旱性和光合效率提供了候选基因。     

小麦PHO基因家族全基因组鉴定及表达分析

PHO基因家族主要参与磷酸盐的转运,在植物生长发育中起重要作用。为研究小麦PHO基因家族成员的潜在功能,本研究从小麦全基因组中鉴定PHO基因家族成员,并利用生物信息学手段对其基因结构特征、蛋白结构域、系统进化、顺式作用元件及表达特性进行分析。结果在小麦全基因组中共鉴定到12个PHO基因家族成员,所有成员均含有SPX和EXS结构域。系统进化、保守结构域和基因结构分析发现,小麦PHO蛋白与拟南芥PHO1-H1蛋白以及水稻PHO1蛋白亲缘关系较近;除TaPHO7、TaPHO10、TaPHO11和TaPHO12蛋白缺少部分基序外,其余小麦PHO蛋白均具有完整基序,且同一亚组内的成员具有相似的蛋白保守结构域和基因结构,说明PHO亚家族成员间高度保守。顺式作用元件分析发现,小麦PHO基因启动子区域含有与磷调控相关的激素诱导、光响应、低温响应等元件。基于RNA＿seq数据的组织特异性分析发现,大部分PHO基因在根中的表达量较高。qRT-PCR分析发现,低磷胁迫处理下磷高效小麦品种小偃54地下部分(根) TaPHO7和 TaPHO8基因的表达量显著高于对照。     

小麦SnRK2家族基因鉴定及进化分析

SnRK2是一种植物特异性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在植物生长发育和胁迫耐受信号传递过程中发挥着至关重要的作用。为探索SnRK2在小麦抗逆中的作用，基于最新的小麦基因组信息，采用blastp和hmmer两种方法在普通小麦中共鉴定到30个SnRK2基因家族成员。系统发育分析表明，SnRK2基因在普通小麦及其祖先物种的进化过程中高度保守。利用RNA seq数据分析小麦SnRK2基因在不同组织以及不同胁迫条件下的表达模式，结果表明，小麦SnRK2基因家族成员在不同组织以及不同胁迫条件下表达量均存在差异，且具有显著的组织特异性。通过qRT PCR进一步验证6个小麦SnRK2基因的表达模式，发现不同基因之间的表达量存在明显差异，推测小麦SnRK2基因家族的部分成员出现功能分化。随后，利用已发表的六倍体小麦重测序数据，分析不同小麦群体中SnRK2基因的核苷酸多样性(P_i)和分化指数(F_st)，并解析单倍型，推测Ta 5B SnRK2.28基因的AA单倍型为优异等位变异。通过同源建模预测小麦SnRK2蛋白的三维结构，发现小麦SnRK2蛋白结构在进化上高度保守。     

普通小麦TaADF8基因的克隆及表达分析

肌动蛋白解聚合因子(actin-depolymerizing factor,ADF)普遍存在于真核细胞中,为低分子量的肌动蛋白结合蛋白,在调控细胞内肌动蛋白纤维的聚合和解聚中起关键作用。为给深入研究TaADF8基因在小麦中的功能机理奠定基础,并为进一步丰富小麦ADF基因研究内容提供理论参考,本研究利用电子克隆策略从小麦品种CP53中克隆出TaADF8基因(GenBank登录号为KJ864962)后对其进行序列分析,并进一步采用荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对其在小麦不同组织间的表达差异及不同非生物胁迫下的表达模式进行分析。核酸序列分析表明,该基因全长695bp,拥有完整的ORF,编码142个氨基酸。氨基酸序列分析表明,该蛋白含有保守的ADF同源区和PIP2结合结构域,且在氨基端有核定位信号。进化和聚类分析表明,小麦TaADF8基因与大麦HvADF2基因、HvADF3基因和水稻OsADF3基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为75.35%、93.66%和67.86%。qRT-PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶、颖壳和雄蕊中均表达,且在根、叶和雄蕊中表达量较高;该基因表达受低温的强烈诱导,同时也受水分、高盐和外源脱落酸胁迫诱导。     

小麦DNA去甲基化酶基因全基因组鉴定及其在籽粒发育中的表达分析

DNA去甲基化酶（dMTase）是一种高度保守的表观遗传修饰因子,涉及许多生物学过程,包括生长发育、应激反应和次生代谢。本研究基于小麦基因组数据,对小麦 DNA去甲基化酶基因（TadMTase）进行了全面鉴定和生物信息学分析。结果表明,小麦基因组中包含18 个TadMTase基因,分布于小麦15条染色体上。系统进化分析将TadMTase分为 ROS、DML3、DML4 和 DML5等 4个亚家族,亚家族之间的TadMTase基因序列长度和内含子数量存在差异,但同一个系统进化树分支中的亚族成员具有高度相似的基因结构、保守 motifs 和结构域,为植物dMTase基因家族的直系同源基因,在进化方面具有保守性。亚细胞定位预测TadMTase均定位于细胞核中;通过与小麦祖先物种的进化及共线性分析,发现在小麦异源六倍体形成过程中存在部分TadMTase基因丢失;TadMTase基因家族启动子区域包含大量光信号、植物激素、胁迫响应和生长发育等相关顺式作用元件;转录组数据分析表明TadMTase基因在不同组织器官和籽粒发育不同时期表达模式不同,有一定的组织特异性。进一步RNA-Seq和荧光定量PCR分析表明TaROS1b-1A.1和TaROS1a-5A/D分别在籽粒的种皮和胚乳发育时期显著上调表达,且在强筋和弱筋小麦品种中表达存在差异。结果为TadMTase 基因在调控小麦籽粒生长发育及其品质形成中的调控机制提供参考。     

小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆及赤霉病菌诱导下的表达分析

木瓜类半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）作为一类重要的蛋白水解酶,在植物生长发育以及胁迫应答过程中都发挥着重要作用。本研究从抗、感赤霉病小麦品种差异表达基因谱中获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST（表达序列标签）,以此序列检索小麦最新基因组数据库并设计引物,从小麦中克隆到3个基因,分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D,属于PLCPs RD21家族。序列分析表明,3个基因的开放阅读框长度分别为1 410、1 428和1 419 bp,分别编码469、475和472个氨基酸。序列比对发现,3个基因的序列相似性为89.3％,所编码蛋白的氨基酸序列相似性为95.6％。系统进化分析表明,TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白的同源性较高,且与乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白聚为一类。qRT-PCR分析表明,3个TaRD21基因均受水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)以及赤霉病菌诱导表达;感病品种中,TaRD21-2A对SA和赤霉病菌的响应更迅速,且表达量较高;抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速。     

Cloning, expression and characterization of novel avenin-like genes in wheat and related species

B-Type avenin-like genes and proteins were characterized in 23 species of Triticeae. Southern blot analysis showed that the avenin-like genes belong to a multigene family. RT-PCR showed expression only in developing endosperms of wheat and related species, between 3 and 22 DPA (days post anthesis) with a peak between 11 and 15 DPA in wheat. The encoded proteins are cysteine-rich, containing 18–19 cysteine residues. An avenin-like protein from wheat was expressed in Escherichia coli, purified and used to raise polyclonal antibodies. These antibodies were used to detect b-type avenin-like proteins in endosperms of wheat and related species by western blotting.