多个顺式作用元件调控t-PAcDNA乳腺定位表达

由牛 β-酪蛋白 ( β-Casein)启动子与大鼠乳清酸蛋白 ( WAP)启动子融合及串联构建成 2个组织纤溶酶原激活剂 ( t-PA) c DNA乳腺定位表达载体 p SVL-βΔWAP-PA和 p SVL-WAPβ-PA。将这 2种表达质粒分别注入怀孕家兔乳腺导管中 ,溶圈试验结果显示 ,2种质粒均能在家兔乳腺中表达 ,且以分娩后第 5天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 70 0 μg/ L和 50 0 μg/ L。本试验为进一步研究 t-PA基因乳腺定位表达调控和建立 t-PA乳腺生物反应器奠定了基础     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术，从小鼠基因组中克隆了1．6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5’上游调控序列，经酶切和测序证实与已知序列基本一致。为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达，将此序列与报告基因CAT融合，构建了pWAP—CAT—polyA乳腺定位表达载体，脂质体包裹后，经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达。分别于家兔分娩后1—10d采奶，用ELISA检测乳汁中CAT含量。结果表明，所构建的载体在家兔乳腺中能够表达，表达水平在家兔分娩后1—5d较高。     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术,从小鼠基因组中克隆了1.6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5′上游调控序列,经酶切和测序证实与已知序列基本一致.为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达,将此序列与报告基因CAT融合,构建了pWAP-CAT-polyA乳腺定位表达载体,脂质体包裹后,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达.分别于家兔分娩后1～10 d采奶,用ELISA检测乳汁中CAT含量.结果表明,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达,表达水平在家免分娩后1～5 d较高.     

乳清酸蛋白基因调控序理的鉴定及转基因小鼠乳腺表达G—CSF载？…

乳清酸蛋白基因亚克隆、酶切鉴定,并对该基因５区进行克隆物序更分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列、指导入Ｇ－ＣＳＦ基因的真核表面质粒,以用于转基因动物乳腺表达研究。     

牛β—酪蛋白基因上游调控序列PCR扩增及克隆

采用蛋白酶Ｋ法从母牛肝中提取染色体ＤＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板。以引物设计软件从牛β－酪蛋白基因上游６００ｂｐ至第１个外显子设计引物,引物长度１９ｎｔ,跨度６３７ｂｐ。扩增产物电泳结果显示,在分子量Ｍａｒｋｅｒ６５７ｂｐ带附近,出现一明显亮带,这一结果与设计产物大小基本一致。用低温冷冻法纯化ＰＣＲ产物,煮沸裂解法提取载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫｓ＋质粒,ＥｃｏＲＶ酶切质粒ＤＮＡ,Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接ＰＣＲ扩增片段和质粒ＤＮＡ。将重组质粒ＤＮＡ转化到ＪＭ１０１大肠杆菌中,经筛选、酶切、测序鉴定,结果表明所克隆的片段为牛β－酪蛋白基因上游调控序列。     

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

乳清酸蛋白基因调控序列的鉴定及转基因小鼠乳腺表达G-CSF载体的构建

乳清酸蛋白基因经亚克隆、酶切鉴定,并对该基因５′区进行克隆和序列分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列、指导人Ｇ－ＣＳＦ基因的真核表达质粒,以用于转基因动物乳腺表达研究。     

褪黑素膜受体在泌乳期奶山羊乳腺的表达及褪黑素对乳腺β-酪蛋白表达的影响

此试验旨在研究褪黑素膜受体(Melatonin membrane receptors, MT)在奶山羊乳腺中的分布和表达及褪黑素对奶山羊乳腺β-酪蛋白(β-casein)表达的调节作用。以泌乳期奶山羊为研究对象,采用Real-time PCR和免疫组织化学染色方法检测MT1和MT2在泌乳期不同阶段奶山羊乳腺中的表达和分布;褪黑素处理体外培养的泌乳期乳腺组织,Real-time PCR方法检测其β-酪蛋白mRNA的表达情况。结果发现:(1)MT1和MT2 mRNA在泌乳期奶山羊乳腺都有表达,并具有相同的表达趋势,泌乳高峰期(泌乳期60 d)显著高于泌乳上升期(泌乳期30 d)和泌乳下降期(泌乳期120 d)(P0.05);(2)MT1和MT2主要定位于乳腺上皮细胞,泌乳高峰期为强阳性,泌乳上升期和下降期阳性反应较弱;(3)褪黑素处理能显著下调乳腺组织β-酪蛋白mRNA的表达(P0.05)。结果表明,褪黑素能直接作用于乳腺,调节泌乳期奶山羊泌乳活动。     

山羊β-酪蛋白启动子指导的通用表达载体及乳腺暂时表达系统

为了实现外源蛋白在动物乳腺中的特异性高效表达，利用山羊β-酪蛋白5’端1．132kb的侧翼调控序列、牛生长激素基因polyA(BGHPA)序列、基质结合区(matrixattac}linentregion，MAR)和多克隆住点(MCS)，构建了乳腺组织定位通用表达裁体pMRPA，鉴定正确后，将2．1kb的人组织型纤溶酶原激活荆(tissue—type plasminogen activator，tPA)cDNA克隆到pMRPA多克隆位点，获得重组表达载体pMRPA—tPA。在不同的泌乳时间，使用不同的包裹剂，采用不同的剂量，将pMRPA—tPA注入泌乳期山羊乳腺组织进行暂时表达。结果显示，所构建的乳腺组织特异性通用表达载体能够有效地指导目的基因的高效表达。通过乳腺暂时表达试验进一步发现，泌乳稳定期表达效果最好，tPA表达水平在2．020～6．959mg／L；表达量随DNA用量的增加而提高；使用普通包裹剂和裸质粒相比，普通包裹剂对表达效果无明显影响。本试验对乳腺暂时表达系统进行了系统性研究，为通过乳腺暂时表达系统改良乳汁蛋白组成提供了重要依据。     

雌激素对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白和甘油三酯表达的影响

为探讨雌激素对乳腺上皮细胞中酪蛋白及甘油三酯表达的影响,试验于2018年2月至2018年4月在新疆肉乳用草食动物营养实验室进行,实验选取扩增生长状态良好的乳腺上皮细胞,添加0、50、100、200μmol/l雌激素孵育乳腺上皮细胞后,分别在12、24、48、72 h后检测各组细胞酪蛋白及甘油三酯表达的情况。结果显示,在12 h时,添加50μmol/l雌激素组CSN1的表达量极显著高于对照组(P<0.01),添加50μmol/l雌激素组TG表达量极显著高于对照组(P<0.01);50μmol/l雌激素添加组CSN1表达量显著高于200μmol/l雌激素添加组(P<0.05),且极显著高于100μmol/l雌激素添加组(P<0.01),100μmol/l雌激素添加组CSN2表达量显著高于200μmol/l雌激素添加组(P<0.05),50μmol/l雌激素添加组TG表达量极显著高于100、200μmol/l雌激素添加组(P<0.01);添加50μmol/l雌激素时,12、48、72 h的CSN1表达量显著高于24 h(P<0.05),在72 hCSN2表达量显著高于其他各时间点(P<0.05),24、72 h时TG表达量显著高于12、48 h(P<0.05)。结果发现,添加雌激素可以促进乳腺上皮细胞中CSN1、CSN2及TG的表达。200μmol/l在一定条件下促进CSN1的表达效果最好;100、200μmol/l雌激素添加组均能够促进CSN2的表达,且100μmol/l促进CSN2的表达效果最好,尤其是在12、24 h;50、200μmol/l雌激素添加组可以促进TG的表达,但100μmol/l雌激素添加组能够抑制TG的表达。     

乳蛋白基因的表达调控及其应用

近年来，乳蛋白基因在乳腺组织的高效、特异性表达的调节机制是人们研究的热点。随着研究的不断深入，其调控序列的结构已日渐清楚，而利用其调控序列构建乳腺特异性表达载体也成为人们关注的焦点。现就乳蛋白基因的表达调控及应用其构建乳腺生物反应器表达载体的研究概况作一综述。     

乳蛋白基因在转基因动物乳腺细胞中特异性表达的研究进展

乳蛋白是乳的主要营养成分，乳蛋白的种类及其在乳中的浓度都影响乳的品质，而乳中各乳蛋白的含量都受到相应乳蛋白基因的控制。通过转基因技术，可以在转基因动物乳腺细胞中特异性地表达目的蛋白，从而改善乳的品质以及生产具有特殊药用价值的乳产品。本文主要概述乳蛋白多态性及其作用，乳蛋白基因及多态性，并着重介绍乳蛋白基因在转基因动物体内的表达调控；通过介绍大量转基因试验的研究成果，以探寻改变乳成分的分子遗传基础。     

牛BLG基因5’调控序列控制GFP基因在原代乳腺上皮细胞中的表达

采用胶原酶分阶段消化法对家兔的原代乳腺上皮细胞进行了分离培养，并且构建了以牛ヂ-乳球蛋白(BLG)基因5，调控序列为启动子、以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因的真核表达载体。将该载体转染兔原代乳腺上皮细胞，然后用不同质量浓度的皮质醇、胰岛素和催乳素诱导。结果表明，用5mg／L催乳素 5mg／L胰岛素 1mg／L皮质醇诱导，在诱导36h后开始有荧光出现。诱导48～60h时荧光更强一些，而未经诱导的细胞GFP则不表达。     

谷氨酰胺对离体培养的泌乳母猪乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白基因表达的影响

为探讨谷氨酰胺(Gln)在泌乳母猪乳腺组织的正常发育和泌乳功能中的调控作用,研究选用6头大白纯种母猪,于泌乳第21天,采集所有母猪具有正常泌乳功能的乳腺组织用于分离乳腺上皮细胞。采用RT-PCR方法鉴定该细胞为猪乳腺上皮细胞,且具有分泌β-酪蛋白的功能;将纯化后处于对数生长期的乳腺上皮细胞接种到培养板上,分别用含0.20、0.16、0.12、0.08、0.04、0.01、0 mmol/mL Gln的培养液进行培养,检测细胞增殖率及其β-酪蛋白表达量。结果表明:Gln添加量在0.08~0.16mmol/mL范围时可显著促进猪乳腺上皮细胞的增殖(P<0.05),且显著提高其β-酪蛋白表达丰度(P<0.05),其中以0.12 mmol/mL浓度效果最显著。结果提示,适宜浓度的Gln能促进泌乳母猪乳腺组织的发育,并能提高乳蛋白的合成量。     

影响猪肉质性状的基因及其表达调控

猪肉质主要受遗传、营养和饲养、屠宰加工条件等多种因素的影响。但从本质上讲,猪肉质性状主要由基因控制。本文系统综述了影响肉质性状的基因以及营养对这些基因表达的调控。为从分子水平深入开展肉质的研究提供参考。     

hEPO乳腺定位表达载体的构建及其在大鼠和家兔乳腺中的暂时表达

将人红细胞生成素（ｈＥＰＯ）基因组ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）与大鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的上游调控序列融合,分别构建了ＰＷＡＰＥＰＯ－ＷＡＰ３‘ＵＴＲ（ＰＷＥ３’）和ＰＣＭＶ－ＷＡＰ－ＥＰＯ－ＢＨＧｐｏｌｙ（ｐＣＷＥＡ）２个乳腺中位表达载体,表达载体经脂质体包裹后,以显微外科方法,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠和家兔腺内,进行暂时表达。分别大于分娩后４８、７２ｈ,家兔分娩后１－１０ｄ采奶,ＥＬＩＳＡ方法检     

奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导

本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好.     

中草药添加剂对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能影响

为探讨中草药添加剂对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取3种与泌乳功能相关的中药（甲珠、通草、蒲公英）,应用CASY细胞分析仪及HPLC分别检测其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、细胞活力及乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖的影响。试验结果表明,通草对乳腺上皮细胞泌乳性能影响不显著（P〉0.05）;甲珠和蒲公英对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白和乳糖分泌有显著的促进作用（P〈0.05）,并呈一定的剂量依赖效应,综合考虑确定蒲公英30 mg/mL为其最佳作用浓度。     

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的研究

利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因的重组质粒，并导入到山羊乳腺上皮细胞，经G418及PCR筛选获得阳性细胞；转染细胞增殖后经激素诱导，培养液上清通过Western blot检测证明，转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白，其分子质量为58ku。