生糖底物和神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA表达水平的影响

在原代单层培养的新生犊牛肝细胞培养液中分别加入不同浓度丙酸钠、丙酮酸钠、胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白，培养12h后，应用半定量RT-PCR方法检测体外培养的肝细胞PEPCK—C mRNA的丰度。结果显示，随着丙酸钠、丙酮酸钠浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度均先升高后下降（P〈0．01）；随胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度分别剂量依赖性地降低、升高（P〈0．01）和无显著变化。表明，丙酸钠、丙酮酸钠能通过上调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而促进肝糖异生代谢，但上调作用是有限的；胰岛素能通过下调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而抑制肝糖异生代谢，且下调作用呈剂量依赖性；胰高血糖素与胰岛素作用刚好相反；瘦蛋白未起直接的调节作用。     

p38介导β-羟丁酸对原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响

本试验旨在探讨β-羟丁酸（BHBA）对体外原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响以及p38MAPK在其中的调控作用。选择培养72h的肝细胞,添加不同浓度的BHBA（0、0．6、1．2、2．4mmol／L）,培养9h,每个浓度3个重复。另外选取细胞,p38MAPK抑制剂SB203580（10pmol／L）预处理1h后,添加BHBA,使其终浓度为2．4retool／L;PI／An—nexinV—FITC双染,运用荧光显微镜观察肝细胞凋亡情况;ELISA法检测p38的活性;实时荧光定量PCR方法检测p38、Caspase-3、Caspase9、bcl2基因的mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,1．2和2．4mmol／I—BHBA组的肝细胞凋亡明显增加;p38酶活性明显升高;p38、caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平均显著增加（P〈0．01）。bcl2基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．05）;添加p38抑制剂后,caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．01）,bcl-2基因mRNA表达水平显著增加（P〈O．05）。高浓度的BHBA可以诱导体外原代培养犊牛肝细胞凋亡,p38在BHBA诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。     

神经肽Y对犊牛肝细胞PEPCKmRNA丰度及其活性的影响

取单层培养36 h生长良好的犊牛肝细胞.采用单因素重复试验,分别添加0、50、100、200、500、1 000 ng/L的羊体外合成神经肤Y(Neuropeptide Y,NPY),每个处理3个重复(每个重复2孔),再培养12 h后分别提取RNA和制备细胞上清液.应用荧光定量PCR方法检测外源NPY对肝细胞糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)基因表达的影响,同时用比色法检测其对肝细胞PEPCK活性的影响.结果表明,一定浓度的NPY显著促进肝细胞PEPCK mRNA表达,增强了PEPCK活性.     

瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素（Leptin）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（p〈0.01）;研究结果表明瘦素直接调控奶牛肝胰高血糖受体mRNA的表达。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）和葡萄糖（GLU）在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果，随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高，GLNRmRNA的表达量逐渐增加（P〈0．01）。表明，代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞CPT-Ⅰ和CPT-ⅡmRNA表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加不同浓度的胰岛素（insulin,INS）（0、1、10、100、1 000nmol/L）和胰高血糖素（glucagon,GLN）（0、1、10、100、1 000nmol/L）,每个处理做3个重复,分别培养1h后,提取总RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法,检测肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅰ）和肉碱棕榈酸转移酶Ⅱ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅱ）mRNA表达的变化。结果显示,随着培养液中INS含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量逐渐降低,呈现一定的剂量依赖性。随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量均升高,呈现一定的剂量依赖性,且当GLN的添加浓度高于100nmol/L时,CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量显著升高（P〈0.01）。结果表明,INS可在一定程度上抑制脂氧化关键酶的表达,GLN可显著促进脂氧化关键酶的表达。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明代谢产物在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和葡萄糖,采用内对照RT-PCR方法检测代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA丰度的影响。结果显示,随着培养液中NEFA和葡萄糖浓度的升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性上调(P<0.01);随着BHBA浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。结果表明,NEFA和葡萄糖对肝细胞MTP mRNA表达具有促进作用,呈剂量依赖性:BHBA对肝细胞MTP mR-NA表达具有低剂量促进高剂量抑制的双重作用。     

瘦蛋白对犊牛肝细胞PEPCK mRNA表达及其活性的影响

取单层培养36 h生长良好的犊牛肝细胞,采用单因素重复试验,分别添加0、2.5、5、10、50、100 ng/mL的牛重组牛瘦蛋白(leptin),每个处理3个重复(每重复2孔),再培养12 h后分别提取RNA和制备细胞上清液.应用荧光定量PCR方法检测外源NPY 对肝细胞糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)基因表达的影响,同时用比色法检测其对肝细胞PEPCK活性的影响.结果表明:一定浓度的leptin显著抑制了肝细胞PEPCK mRNA表达,降低了PEPCK活性.     

脂联素对犊牛肝细胞脂氧化关键酶表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加0、16、64和128μg/L脂联素（adiponectin,ADPN）,分别培养4、8h后,提取细胞总RNA。应用实时荧光定量PCR方法,检测脂氧化关键酶脂酰辅酶A氧化酶（ACO）、肝脏脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、肉碱脂酰转移酶-Ⅰ（CPTⅠ）、肉碱脂酰转移酶-Ⅱ（CPTⅡ）mRNA表达变化。结果显示,在ADPN作用4h后,ACO、L-FABP、CPTⅠ、CPTⅡ基因mRNA水平均随ADPN浓度的增加而增加,且均显著高于对照组,呈剂量依赖关系;作用8h时,ACO表达也增加,但差异不显著,L-FABP在中高剂量组显著高于对照组,CPTⅠ和CPTⅡ在各ADPN处理组均显著高于对照组。结果表明,ADPN可显著促进脂氧化关键酶的表达,增强肝脏脂氧化作用,减少肝脂储存。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞FAS mRNA表达的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素与脂肪酸合成酶（FAS）的关系,在体外培养良好的脂肪细胞中添加不同浓度的胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLU）,每个激素设置6个浓度梯度,培养12h后,通过荧光定量PCR技术,观测胰岛素、胰高血糖素对FAS mRNA丰度的影响。结果显示,胰岛素促进了FAS mRNA的表达,而胰高血糖素抑制了FAS mRNA的表达。结果表明,胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中FAS mRNA的表达。     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明神经内分泌因子在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白,采用内对照RT-PCR方法检测神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)mRNA丰度的影响。结果显示,随着细胞培养液中胰岛素和胰高血糖素浓度升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性下降(P<0.01);随着瘦蛋白浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。这表明胰岛素和胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,呈现剂量依赖性;瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA表达具有低剂量促进而高剂量抑制的双重作用,且均呈现剂量依赖性。     

纳米氧化铜对鸡肝细胞CP mRNA表达及培养基质中肝酶活性的影响

将培养48h的鸡原代肝细胞随机分为13组,每组3个重复。第1组为对照组,第2～5、6～9和10～13组分别以硫酸铜、氧化铜和纳米氧化铜的形式添加铜2、4、8、16mg/L,继续培养24h后检测上清中AKP、AST、ALT、γ-GT和LDH活性,用实时荧光定量PCR法检测肝细胞CP mRNA表达量。结果显示,以硫酸铜形式添加铜2～16mg/L、以氧化铜形式添加铜8～16mg/L和以纳米氧化铜形式添加铜16mg/L,培养基质中γ-GT活性均显著高于对照组（P〈0.05）;添加铜2mg/L时,硫酸铜组γ-GT活性显著高于纳米氧化铜组（P〈0.05）,添加铜8mg/L时,氧化铜组γ-GT活性显著高于纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜2mg/L时,硫酸铜和氧化铜组AST和LDH活性显著高于对照组和纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜2mg/L时,氧化铜组ALT活性显著高于纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜8mg/L时,硫酸铜和氧化铜组AKP活性显著高于对照组和纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜2～8mg/L时,肝细胞CP mRNA表达量显著高于对照组（P〈0.05）;添加铜2mg/L时,纳米氧化铜组肝细胞CP mR-NA表达量显著高于氧化铜组（P〈0.05）,氧化铜组显著高于硫酸铜组（P〈0.05）;肝细胞CP mRNA表达量随铜添加量的增加而降低。结果表明,基质中铜达到2mg/L时,纳米氧化铜比硫酸铜、氧化铜更有利于肝细胞生长,纳米氧化铜对体外培养肝细胞的损害作用低于硫酸铜和氧化铜。     

非酯化脂肪酸对体外培养犊牛原代肝细胞中炎性因子表达及其活性的影响

在建立犊牛原代肝细胞体外培养模型的基础上，通过培养液中添加不同浓度的非酯化脂肪酸（Nonesterifiedfatty acids，NEFAs），运用实时荧光定量PCR和ELISA方法，测定NEFAs对肝细胞中炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达及其活性的影响。结果显示，NEFAs作用肝细胞9h后，与对照组相比，高浓度NEFAs（1．8mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β的mRNA表达水平显著增加（P〈0．05），IL-6的mRNA表达水平在2．4retool／L时极显著增加（P〈0．01），低浓度NEFAs（0．6、1．2mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平无显著差异（P〉0．05）；并且TNFα、IL-1G的活性在NEFAs浓度达到1．8、2．4mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），且呈剂量依赖性作用，IL-6的活性在在NEFAs浓度达到1．8mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），在2．4mmol／L也高于对照组，但差异不显著。结果表明，高浓度NEFAs在-定程度上能引起或加剧奶牛肝细胞炎性反应，可能是导致产后奶牛肝功能炎性损伤主要因素。     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、瘦素(LEP)在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR ( real time fluorescent quantitative PCR)法观察了神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In的升高，GLNR mRNA表达逐渐增加（P<0.01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNR mRNA表达逐渐降低（P<0.01）；而随着培养液中LEP浓度的升高，GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（P<0.01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP直接调控奶牛肝脏GLNR mRNA的表达。     

神经肽Y对犊牛肝细胞PC mRNA丰度及其活性的影响

取单层培养72 h生长良好的犊牛肝细胞,采用单因素重复试验,分别添加0、50、100、200、500、1000 pg/ml的羊体外合成神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）,每个处理3个重复（每重复2孔）,再培养12 h后分别提取RNA和制备细胞上清液。应用荧光定量PCR方法检测外源NPY 对肝细胞糖异生关键酶丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase,PC）基因表达的影响,同时用比色法检测其对肝细胞PC活性的影响。结果表明,一定浓度的NPY显著促进了肝细胞PC mRNA表达,增强了PC活性。     

乙酸和β－羟丁酸对体外培养牛肝细胞脂代谢部分关键酶表达的影响

本研究以体外原代培养的奶牛肝细胞为模型,添加不同浓度的乙酸（AcOH）和p羟丁酸（BHBA）,探讨其对奶牛肝细胞脂肪酸代谢关键酶基因表达的影响。添加不同浓度乙酸和β－羟丁酸,培养24h后,提取细胞总RNA。应用实时荧光定量PCR方法,检测脂代谢关键酶长链脂酰辅酶A合成酶1（ACSLl）、柠檬酸合成酶（CS）和乙酰辅酶A羧化酶α（ACCα）mRNA丰度的变化。结果显示,适当浓度的AcOH能够促进肝细胞脂肪酸活化及氧化途径关键酶ACSLl和CS的转录,而高浓度AcOH能够抑制脂肪酸从头合成途径关键酶ACCα的转录;高浓度BHBA能够抑制肝细胞ACSLl、CS和ACCα的转录。说明血液中适当浓度的AcOH能够促进肝脏脂肪酸氧化并抑制脂肪酸从头合成,高浓度BHBA能够抑制肝脏脂氧化和合成,影响乳脂前体物的供应,进而影响乳脂合成。     

高表达线粒体融合蛋白2(MFN2)可抑制高BHBA活化的奶牛肝细胞NF-κB炎性通路

为研究线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)对高β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)活化NF-κB炎性通路的影响,体外培养奶牛肝细胞,添加不同浓度(0.0,1.2,2.4,4.8 mmol/L)的BHBA,并转染过表达MFN2的腺病毒,运用Western blot和qRT-PCR技术检测NF-κB炎性通路关键分子的基因和蛋白表达。结果显示,随着BHBA浓度的增加,IKBα和NF-κB p65的磷酸化水平以及IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表达均显著升高,MFN2的基因和蛋白表达水平则显著降低;过表达MFN2后,显著抑制了高BHBA诱导的IKBα和NF-κB p65磷酸化水平及IL-1β、IL-6、TNFαmRNA表达水平的升高。结果表明,在奶牛肝细胞中过表达MFN2可以显著抑制高BHBA活化的NF-κB炎性通路。     

不同浓度胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因表达的影响

应用Real-time PCR方法检测不同浓度(0、1、10和100 ng/mL)胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)处理后的体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因mRNA的相对表达量。结果表明,添加不同浓度IGF-Ⅰ对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞IGF-Ⅰ受体基因(IGFIR)、IGF-Ⅰ结合蛋白-3基因(IGFBP3)、α-s1-酪蛋白基因(CSN1S1)和κ-酪蛋白基因(CSN3)mRNA的相对表达丰度均无显著影响(P>0.05)。随着IGF-Ⅰ添加浓度的增加,β-酪蛋白基因(CSN2)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACACA)、脂肪酸合成酶基因(FASN)和脂肪酸结合蛋白-3基因(FABP3)mRNA的相对表达丰度显著上调(P<0.05)。提示,IGF-Ⅰ作为一种重要细胞因子参与调节乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪相关基因mRNA的表达。     

NEFA BHBA对体外培养牛肝细胞的HP和SAA mRNA表达的影响

为了验证奶牛酮病发病过程中机体会产生大量的NEFA(非酯化脂肪酸)、BHBA(β-羟丁酸)可能是脂类代谢关键的调节因素。本试验通过对培养的牛肝细胞添加NEFA和BHBA研究NEFA以及BHBA对牛肝细胞的结合珠蛋白(hap-toglobin,HP)和血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein,SAA) mRNA表达的影响。根据荧光定量PCR法测定NEFA、BHBA对体外培养牛肝细胞的HP和SAA mRNA表达的影响,以及NEFA、BHBA等代谢产物对急性期反应蛋白HP、SAA表达影响的结果,得出结论,中等浓度的NEFA对于体外新生犊牛肝细胞中的HP、SAA基因的表达具有促进作用,高浓度的NEFA对HP、SAA基因的表达影响较小;中等浓度的BHBA体外新生犊牛肝细胞中的HP、SAA基因的表达具有一定的抑制作用,中高浓度抑制作用不明显,对于SAA基因,只有BHBA在1. 2 mmol/L浓度下抑制作用明显,高浓度的BHBA对HP、SAA基因的表达影响很小。     

胰岛素对体外培养牛肝细胞胰岛素受体mRNA水平的影响

在新生牛单层肝细胞培养液中添加胰岛素,其浓度分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L,处理12h,应用半定量RT-PCR方法研究胰岛素对体外培养新生牛单层肝细胞胰岛素受体(IR)mRNA水平的影响.结果表明随胰岛素浓度的升高,肝细胞IRmRNA丰度呈下降趋势,指示肝细胞内IRrnRNA丰度下降以调节胰岛素浓度.