西藏牦牛IGF2基因内含子8遗传多态性及其遗传效应分析

以胰岛素样生长因子2(IGF2)基因内含子8作为影响西藏牦牛生长性状的候选基因,研究并分析其与生长性状的相关性,以期利用分子标记辅助选择等育种措施为我国西藏高山牦牛进行种质资源保种选育提供理论根据。本研究采用PCR产物直接测序法对帕里牦牛、申扎牦牛、斯布牦牛和类乌齐牦牛4个品种(类群)共151个样本的胰岛素生长因子2(IGF2)基因内含子8部分序列进行了单核苷酸多态性研究,并分析候选基因不同基因型与体重、体高、体斜长、胸围和管围等生长性状的相关性。结果表明:①西藏牦牛IGF2基因内含子8部分序列长度为412 bp,在帕里牦牛和申扎牦牛中发现AA、AB、BB 3种基因型,与AA型相比,BB型在307位发生G→C转换,335位发生A→G突变;②对标记基因型生长发育指标(体高、体斜长、胸围、管围、体重)进行差异显著性检验,帕里牦牛BB基因型个体的体重显著高于AB、AA基因型个体(P0.05),申扎牦牛BB基因型个体的体重极显著高于AA基因型个体(P0.01),显著高于AB基因型个体,而在斯布牦牛和类乌齐牦牛中未发现有BB基因型个体。③4个牦牛品种(类群)的BB与AB、AA基因型个体在体高、体斜长、胸围和管围性状上差异不显著;④适合性检验表明3种基因型在西藏牦牛群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。由此可得,IGF2基因可能在不依靠骨骼增长的条件下而增加体重量,可作为辅助选择来标记体重量的候选基因。     

草原红牛IGF2基因外显子4的遗传多态性及遗传效应分析

运用PCR-SSCP方法检测草原红牛IGF2基因第4外显子的多态性,采用最小二乘法拟合线性模型将突变位点的不同基因型与牛胴体和肉质性状进行关联分析.结果表明:在外显子4上有1个SNP位点(C250G),该基因具有AA和AB 2种基因型,草原红牛AB基因型个体肋脂质量比AA基因型个体高3.1%(P＜0.05),骨质量和眼...     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGFI基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点。应用RFLP、CRS—RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布。结果表明：（1）IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1317bp、712bp和1941bp;（2）在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G—A突变;内含子3的第40个碱基为一个“A”的插入-缺失突变,第307位为C—T突变,683位是G—A突变;内含子4上的696碱基处有一个20bp的插入-缺失突变,在1563位为G—A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;（3）内含子1上SNPG1070A的A等位基因能为HindIII限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型。根据内含子1上SNPG208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成TaqI酶切位点,建立CRS—RFLP检测方法。内含子4上SNPG1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型。试验结果显示,RFLP、CRS—RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;（4）在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNPG1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低。     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGF-I基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点.应用RFLP、CRS-RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布.结果表明:(1)IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1 317 bp、712 bp和1 941 bp;(2)在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G-A突变;内含子3的第40个碱基为一个 "A" 的插入-缺失突变,第307位为C-T突变,683位是G-A突变;内含子4上的696碱基处有一个20 bp的插入-缺失突变,在1 563位为G-A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;(3)内含子1上SNP G1070A的A等位基因能为Hind III限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型.根据内含子1上SNP G208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成Taq I酶切位点,建立CRS-RFLP检测方法.内含子4上SNP G1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型.试验结果显示,RFLP、CRS-RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;(4)在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNP G1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低.     

猪IGF-2基因内含子3突变检测及其多态性分布

采用错配PCR-RFLP法,检测8个品种314头猪IGF-2基因内含子3的3072位点多态性及其在群体中的分布.结果表明:引入错配碱基构造出新的酶切位点,在很大程度上降低了试验成本且不影响基因型判定结果.IGF-2基因内含子3的3072位点(G→A)变异多态在猪群中分布差异极显著.国外品种猪中等位基因A的频率高于我国地方品种猪,我国地方品种猪(二花脸猪、梅山猪、五指山猪、淮猪)群体中绝大多数为GG基因型;而国外品种猪(长白猪、大约克猪、杜洛克猪)群体中GA和AA基因型频率分别为60%～70%和20%～30%.由杜洛克猪与二花脸猪、梅山猪杂交育成的苏太猪,其群体中GA基因型频率接近78%,大大超过地方品种猪.     

贵州地方猪品种脂蛋白脂酶基因第8内含子的多态性研究

以可乐猪、萝卜猪和香猪3个贵州地方猪种和欧洲猪种为材料,采用PCR-SSCP技术对脂蛋白脂酶（Lip-oprotein lipase,LPL）基因第8内含子的多态性进行了研究。以特异性PCR从样品基因组中扩增出163bp的DNA片段,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从两个猪群体的LPL基因第8内含子中都检测到了AA基因型和AB基因型,未检测到BB基因型;欧洲猪品种和贵州地方猪品种均以AB基因型占优势;与欧洲猪品种相比,贵州地方猪品种的B等位基因频率明显较高,A等位基因频率则较低。     

牦牛MSTN基因内含子2多态性及与生长性状的相关性

采用PCR-SSCP技术对大通牦牛、甘南牦牛和天祝白牦牛(共277头)肌肉抑制素基因(MSTN)内含子2的部分序列进行了多态性研究,分析该基因与牦牛生长性状的相关性.结果表明,牦牛MSTN基因内含子2存在2个等位基因和3种基因型.在该基因座上,甘南牦牛、天祝白牦牛呈Hardy-Weinberg平衡状态,大通牦牛呈不平衡...     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

黄牛、牦牛和水牛MyoG基因单核苷酸多态性分析

采用PCR-SSCP结合DNA直接测序技术,分析黄牛(鲁西牛、渤海黑牛)、牦牛和水牛肌细胞生成素基因(MyoG)外显子1和5′侧翼部分序列的DNA多态性,旨在揭示中国3个主要家养牛种的群体遗传变异并为开展分子育种提供试验依据。结果表明,鲁西牛和水牛群体存在SSCP多态性。序列分析结果显示,渤海黑牛和牦牛MyoG外显子1和5′侧翼部分序列与GenBank相应序列完全一致。鲁西牛在外显子1发生g.48 G→C颠换,由此形成GG、GC和CC 3种基因型,G、C等位基因频率分别为0.743 7、0.266 4;水牛分化明显,发生6处突变,位于g.-5 A→T颠换导致形成AA和AT 2种基因型,A、T等位基因的频率分别为0.825 0、0.175 0;另外5处突变发生在外显子1序列中,其中g.210 T→C颠换是水牛特异性的限制性酶切位点。所有突变均发生在三联体密码子的第3位,且均为同义替代。编码氨基酸在4个牛群体间完全一致。推测鲁西牛MyoG基因外显子1的g.48 G→C突变可能是一个与生长发育性状存在一定相关性的潜在SNP位点。     

猪H-FABP基因内含子1的遗传多态性及其遗传效应分析

[目的]为H-FABP基因运用于猪育种过程中的标记辅助选择提供基础资料。[方法]应用PCR-SSCP方法分析H-FABP基因在山西白猪、马身猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个猪种的多态性,并研究基因型与肌内脂肪含量的相关性。[结果]在猪H-FABP基因内含子1扩增的片段上发现了一个多态性,检测到2个等位基因（A、B）,3种基因型（AA、AB、BB）,并对纯合子进行测序,发现SSCP的变异是由碱基C→T的替换造成的。基因型在不同猪种分布的多重比较表明,马身猪与山西白猪、长白猪、大白猪、杜洛克猪间基因型分布差异极显著（P〈0.01）,其他纯种猪群间基因型分布差异不显著（P〉0.05）。固定效应模型分析表明,肌内脂肪含量基因型间差异极显著（P〈0.01）。最小二乘分析表明,BB基因型个体与AA基因型个体比较肌内脂肪含量的差异显著（P〈0.05）。[结论]H-FABP基因对猪肉品质存在一定的影响。     

三角帆蚌IGF2基因的亚细胞定位及重组蛋白促体外细胞活性分析

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factors 2, IGF2)在多种细胞生长、分化和合成代谢的调节中发挥重要的调控作用。本研究成功构建了淡水珍珠贝三角帆蚌IGF2的重组质粒pEGFP-IGF2和pET32a-IGF2,通过pEGFP-IGF2-细胞转染,表明该蛋白定位在细胞质与细胞核中。将pET32a-IGF2转化到BL21 (DE3)中进行蛋白诱导表达,成功得到其原核表达载体,SDS-PAGE检测显示,在约25kD处有一条清晰的条带,符合目的条带大小（26.27kD）,且主要表达于上清液中。为研究重组蛋白IGF2对三角帆蚌细胞活性的作用,本研究通过CCK8细胞活性测定,进一步探讨了添加不同浓度重组目的蛋白（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、 12.5 μg/mL、17.5 μg/mL、 22.5 μg/mL）培养的三角帆蚌外套膜细胞增殖活性。结果显示,三角帆蚌IGF2重组蛋白能显著促进三角帆蚌外套膜细胞的增殖活力（P＜0.05）,且在其浓度为12.5 μg/mL时对三角帆蚌外套膜细胞的促生长效果最佳,这为促进三角帆蚌外套膜细胞传代、细胞系建立奠定了基础,也为下一步探究IGF2在贝类中的功能提供依据。     

长白和蓝塘猪印记基因 IGF2 和 H19 的时空表达研究

运用实时荧光定量PCR技术,检测 IGF2和H19 印记基因在长白猪和蓝塘猪中的表达水平.测定了1日龄和180日龄2个阶段的基因在各组织中的转录表达水平,按照生长性状分组,对组间的表达差异进行了比较分析.分析不同日龄长白、蓝塘猪各组织中 IGF2、H19 的表达量.结果显示,仔猪初生体质量大的组肝脏组织中 IGF2 基因表达水平显著高于初生体质量轻的组;180日龄猪皮脂厚的组脂肪组织的 IGF2 基因表达量高于皮脂薄的组;1日龄仔猪肝脏、肌肉和胃组织中 IGF2 表达量高于其他测定组织和180日龄的各组织;180日龄蓝塘猪肾脏组织中的 H19 表达量显著升高.     

不同能量水平对断奶獭兔皮肤组织IGF-1和IGF-1R基因表达的影响

旨在研究不同消化能水平的日粮对断奶獭兔皮肤组织中IGF-1和IGF-1R基因表达的影响。选取45日龄体质量(1 133±71g)的断奶獭兔160只,随机分为4个组,每组40个重复,每个重复1只,分别饲喂消化能为9.70MJ/kg(Ⅰ组)、10.50MJ/kg(Ⅱ组)、11.30MJ/kg(Ⅲ组)和12.10MJ/kg(Ⅳ组)的饲粮,预试期7d,然后进入正式期。在75日龄和105日龄时分别屠宰,取背中部约1cm2皮肤组织样,提取总RNA,反转录,荧光定量PCR法检测皮肤组织中与毛品质相关基因的相对表达水平。结果表明:在獭兔75日龄时,Ⅲ组IGF-1基因的表达量显著高于Ⅰ组(P0.05),Ⅲ组IGF-1R基因的表达水平显著高于Ⅰ组(P0.05)。在獭兔105日龄时,Ⅲ组IGF-1和IGF-1R基因的表达水平仍然最高,但各组间差异不显著。说明在獭兔断奶至约105日龄时,消化能水平维持在11.30MJ/kg较为合适,此时IGF-1和IGF-1R基因mRNA表达水平最高,在充足能量的保证下,獭兔皮肤毛囊与毛发能够快速稳定生长。     

海南黄牛IGF2R基因单核苷酸多态性及其生物信息学分析

【目的】明确海南黄牛胰岛素样生长因子2受体基因（IGF2R）遗传多态性及其在海南黄牛群体中的遗传分布情况,为进一步揭示IGF2R基因对海南黄牛生长性状的调控机理提供理论依据,也为分子标记辅助选择提供新的候选位点。【方法】构建海南黄牛DNA混池,通过PCR扩增和测序技术对海南黄牛IGF2R基因编码区（CDS）进行基因多态性分析,并以Chromas序列比对筛选出错义突变SNP位点;应用PCR-RFLP对202头海南黄牛个体进行基因型鉴定,同时对筛选到的SNP位点进行连锁不平衡及单倍型分析,评估海南黄牛群体中各单倍型的分布情况;通过生物信息学方法分析各单倍型和SNP位点对海南黄牛IGF2R基因CDS区mRNA二级结构、蛋白理化性质及蛋白二级结构的影响。【结果】在海南黄牛IGF2R基因CDS区共检测到4个错义突变SNPs位点,分别为SNP1(g.63977A>G)、SNP2(g.63999T>C)、SNP3(g.69772G>A)和SNP4(g.94987A>C),其中SNP1、SNP2和SNP3位点间呈强连锁不平衡状态。4个SNPs位点在海南黄牛群体中均表现为中度多态...     

绵羊STAT5a基因intron10和exon12遗传特征分析

【目的】研究绵羊STAT5a基因第10内含子和第12外显子的遗传多态性和群体遗传特征。【方法以2个多羔绵羊品种湖羊(140只)和多浪羊(144只)及单羔羊藏绵羊(217只)为研究对象,应用PCR-SSCP方法分析其STAT5a基因第10内含子和第12外显子的遗传多态性和群体遗传特征。【结果】绵羊STAT5a基因第10内含子发现13 210AG突变,检测到3种基因型(AA、AG和GG)和2个等位基因(A和G);第12外显子上发现14 827AG突变,该突变属于同义突变,检测到3种基因型(MM、MN和NN)和2个等位基因(M和N)。在绵羊STAT5a基因第10内含子和第12外显子中,杂合子AG和MN分别为优势基因型,基因型频率在多羔绵羊和单羔绵羊品种间差异极显著(P0.01)。3个绵羊品种的多态信息含量均处于中度多态,藏绵羊的卡方值处于Hardy-Weinberg平衡状态,而湖羊和多浪羊偏离了Hardy-Weinberg平衡状态。【结论】绵羊STAT5a基因具有多态性,且基因型频率在不同产羔数品种间差异极显著(P0.01)。     

牦牛SMAD4基因SNPs检测及其与生长性状的关联分析

【目的】研究牦牛SMAD4基因SNPs与生长性状的关系,探寻与牦牛生长性状相关的分子标记。【方法】采用DNA测序和单倍型分型技术,对青海牦牛SMAD4基因进行SNPs检测及其基因分型、连锁不平衡和单倍型分析,并对多态位点的基因型及组合单倍型与牦牛生长性状的关联性进行分析。【结果】牦牛SMAD4基因在内含子区域存在6个突变位点,其中g.393A>G、g.555A>G、g.6525A>G和g.18360C>T均存在3种基因型,g.582A>T和g.6492C>T均存在2种基因型。连锁不平衡分析发现,6个位点间不存在强连锁不平衡效应。单倍型分析发现,在14种不同的单倍型中,单倍型H₁的发生频率最高。关联性分析表明,g.393A>G位点与体斜长、胸围和管围均显著相关（P<0.05）,g.555A>G位点与体斜长显著相关（P<0.05）,g.582A>T位点与体质量和体高均显著相关（P<0.05）,g.6492C>T位点与体高显著相关（P<0.05）,g.6525A>G位点与体质量显著相关（P<0.05）,g.18360C>T位点与胸围显著相关（P<0.05）。基因型组合发现,单倍型H₁H₁₄可能是影响牦牛生长性状的最优组合。【结论】牦牛SMAD4基因内含子区域上的6个位点与生长性状显著关联,可作为牦牛分子标记辅助选择的候选基因。     

策勒黑羊GDF9和BMP15基因多态性与产羔数关联分析

为了鉴定策勒黑羊BMP15和GDF9中的多态位点,并与产羔数性状进行关联分析,对相同饲养条件下81只具有产羔记录的策勒黑羊BMP15和GDF9基因完整ORF区进行测序。结果显示,在两个重要候选基因中共存在16个多态位点。GDF9基因有7个SNPs（分别为g.41769976G＞A、g.41769833G＞A、g.41769898G＞A、g.41769246A＞G、g.41769008T＞C、g.41769002A＞G）和g.41769723 TCAA缺失,其中：g.41769833G＞A 位点AA型比GG型平均多0.22只（P＜0.05）,其余6个突变位点均与产羔数不存在显著相关（P＞0.05）。BMP15基因存在9个突变位点：g.50986052C＞A、g.50985229A＞G、g.50985162T＞C、g.50985071C＞T、g.50983056C＞G、g.50982538T＞C、g.50981129A＞G、g.50980656T＞C和g.50981170T＞A,且这9个SNP位点与产羔数均不存在显著相关（P＞0.05）。结果可为策勒黑羊种群的保种育种提供理论参考。     

金鱼Dmrt2基因表达分析

采用荧光定量PCR技术检测了Dmrt2基因的两个亚型Dmrt2a和Dmrt2b在金鱼(Carassius auratus)不同发育时期以及不同组织中的表达情况,用RACE技术克隆得到金鱼Dmrt2a cDNA序列的全长为1 755 bp,5’和3’非编码区长分别为188 bp和67 bp,推测的开放阅读框可编码499个氨基酸的多肽。分子系统进化分析表明金鱼Dmrt2a与其它鱼类Dmrt2a基因聚成一支,与斑马鱼(Daniorerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、罗非鱼(Oreochromis Niloticus)Dmrt2a的同源性分别为85%、61%、58%、58%。荧光定量PCR结果揭示,Dmrt2a在精巢中表达量最高,在卵巢中次之,而Dmrt2b在卵巢中表达量最高,在精巢中次之,二者在肾脏、消化道、肝脏、心脏和脑中都有表达,但表达量低;不同发育时期胚胎和仔鱼的Dmrt2a和Dmrt2b表达量变化很大,Dmrt2a在受精后24 h达到最高值,之后表达量降低,而Dmrt2b在孵化后仔鱼中表达量显著增加。     

小麦根系PIP2基因表达响应干旱复水的遗传差异研究

【目的】研究干旱-复水的水分动态变化及品种遗传特性对小麦水孔蛋白基因PIP2表达的影响,揭示小麦生理抗旱性的分子机制。【方法】以抗旱性差异较大的2个小麦品种"陕合6号"(抗旱)和"郑引1号"(干旱敏感)为材料,于幼苗培养至8d时,采用渗透势为-0.4MPa的PEG-8000溶液模拟干旱胁迫处理,胁迫时间分别为0(对照),12,36,60h,胁迫60h后复水36h。运用半定量RT-PCR方法,研究从干旱胁迫到复水的整个过程中,水孔蛋白基因PIP2在2种小麦根系中的动态差异表达情况,以及根系水导、叶片相对含水量、游离脯氨酸含量和细胞膜相对透性的变化。【结果】正常水分条件下,"郑引1号"中PIP2的表达水平高于"陕合6号";而水分胁迫条件下,"陕合6号"中PIP2的表达量普遍高于"郑引1号",且PIP2的表达随水分的动态变化在2个品种中均表现出明显的可塑性。水分胁迫初期(36h内),"陕合6号"中PIP2的表达水平显著高于对照,至60h时又逐渐降低至低于对照水平;而"郑引1号"PIP2的表达量随着水分胁迫时间延长持续降低,至60h时几乎检测不到其表达。胁迫60h后复水36h,2个小麦品种中PIP2的表达量均有恢复,但"郑引1号"的净表达量仍未达到胁迫前的水平,而"陕合6号"则超过了胁迫前的水平,表现出补偿效应。与干旱敏感品种"郑引1号"相比,干旱胁迫下抗旱品种"陕合6号"的高PIP2转录水平对应于植株较高的根系水导、叶片相对含水量和游离脯氨酸含量,同时具有较低的根系细胞膜相对透性。【结论】抗旱品种在水分胁迫初期诱导并维持较高的PIP2表达,复水后PIP2的补偿表达可能是其具有较高抗旱能力的重要机制之一。     

3个牛品种UCP3基因第5内含子和第6外显子部分序列的多态性研究

以中国西门塔尔牛、安格斯牛和海福特牛为试验材料,设计特异性引物扩增解耦联蛋白3基因(UCP3)的第5内含子和第6外显子部分序列,利用PCR-SSCP技术对牛UCP3基因进行了SNPs检测和基因型分析。结果表明,3个牛品种中的优势等位基因均为B,中国西门塔尔牛和安格斯牛的优势基因型为BB型,海福特牛的优势基因型为AB型;中国西门塔尔牛和海福特牛在UCP3基因位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,而安格斯牛在UCP3基因位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态;中国西门塔尔牛和海福特牛在UCP3基因位点为中度多态,安格斯牛在UCP3基因位点为高度多态。