不同生防放线菌组合防治枯、黄萎病研究

【目的】探讨优良放线菌及其组合对西瓜枯萎病和茄子黄萎病的生物防效,筛选出具有良好防效和促生作用的复合菌株。【方法】采用离体抑菌作用测定法和温室人工接菌法,研究不同生防放线菌及其组合对西瓜枯萎病和茄子黄萎病的防效和促生效果。【结果】离体抑菌作用测定结果表明,菌株SC11和SE2的菌体、发酵液和发酵滤液对大丽轮枝菌和西瓜枯萎菌均表现出显著的抑制作用,孢子萌发抑制率高;盆栽试验表明,菌株SC11和SC1复配的C2组合对西瓜枯萎病和茄子黄萎病防效显著,防效分别达到84.93%和71.48%,且高于各菌株单一使用的效果;C3组合的发酵液对西瓜的株高、叶面积和叶绿素含量等生理指标影响突出,经C3处理后的西瓜根系还原强度值最大,对茄子的促生作用仅次于菌株SF6。【结论】生防放线菌组合的防病促生作用优于单个菌株,组合菌株间通过协同作用可达到优势互补,只有全面考虑各菌株的习性并进行合适的组合,才能充分发挥其生防效果。     

大丽轮枝孢和灰葡萄孢生防放线菌的分离筛选

采用诱捕分离法从土壤中分离到28株放线菌,以大丽轮枝孢(Verticillium dahliae)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)作为靶标菌,通过皿内拮抗试验从中筛选出效果明显的SW6,SW9,SW16,SW20 4株生防菌株,其发酵原液对靶标菌的抑制效果明显高于发酵滤液和菌丝初提液。其中,菌株SW20的发酵液对2种靶标菌均有较强的抑制作用。抗药性测定结果表明,4株生防菌株对链霉素最为敏感,对供试杀菌剂抗性较强。     

内生放线菌SG2与生防放线菌SC11融合菌株的筛选

【目的】提高生防放线菌对枯、黄萎病的防治效果。【方法】运用原生质体融合技术,对内生放线菌SG2和生防放线菌SC11进行融合,测定了融合菌株对尖镰孢西瓜专化型和大丽轮枝菌的抑菌效果,并测定了其内生性和产多胺的能力。【结果】获得了G-C1-G-C18共18株形态特征和菌落颜色与亲本菌株有差异、遗传性状稳定的融合菌株,其中G-C1、G-C2、G-C8、G-C10、G-C11、G-C12、G-C16和G-C18等8株融合菌株对大丽轮枝菌的抑菌率均≥70%,G-C12和G-C8对尖镰孢西瓜专化型的抑菌率均>75%。融合菌株分泌物的抑菌效果均有所降低。融合菌株G-C1、G-C2、G-C10、G-C11、G-C12和G-C16继承了亲本SG2的内生性;上述8株融合菌株均继承了双亲产生多胺的特性。【结论】实现了植物内生放线菌和土壤中生防防线菌的原生质体融合,为枯、黄萎病的生物防治奠定了基础。     

非致病尖孢镰刀菌抗药菌株的诱导

在ＰＤＡ平板上，用紫外线照射非致病尖孢镰刀菌３１６菌系分生孢子，获得５２个存活菌株。皿内测定结果表明，以致死率为７５％－８９０％的处理剂量容易获得抗药性菌株。抗药性较强的菌株定殖西瓜幼苗导管的能力均有所下降。     

特殊生境中土壤放线菌的筛选与鉴定

采用土壤稀释法分离采自江苏及广西农化厂周边的6份土样,获得50株放线菌。以大丽花轮枝孢、尖镰孢萎蔫专化型和尖镰孢西瓜专化型为靶标菌,通过皿内试验及盆栽试验筛选出5株具有较强拮抗活性的放线菌。菌丝生长和孢子萌发抑制试验表明,菌株JSGF4、JSGF10和GXCK1对靶标菌有较强拮抗作用;盆栽试验表明,5株放线菌对茄子黄萎病有良好防治效果,其中菌株JSGF10对茄子黄萎病的防效高达90.0%;对防效较高的4株放线菌进行形态特征、培养特征及生理生化特性分析,鉴定菌株JSGF4为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus),菌株JSGF10和GXCK1为白色链霉菌(Streptomyces albus),GXDM6为灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。     

防治西瓜枯萎病的微生物菌种的筛选与鉴定

[目的]对一组防治西瓜枯萎病的微生物菌种进行鉴定。[方法]以西瓜专化型尖孢镰刀菌为研究对象,从海洋海绵共生菌和土壤样品中筛选到6株具显著拮抗西瓜专化型尖孢镰刀菌的活性菌株,并对该6株活性菌株进行分子鉴定。[结果]分子鉴定显示该6株活性菌株均属于芽孢杆菌属的物种。[结论]试验结果为西瓜枯萎病类安全高效的生物农药及功能型生物肥料的创制提供了理论依据。     

引起茄子黄化萎蔫病原菌的分离与鉴定

采用病原形态学观察、接种致病性测定及分子鉴定的方法对引起南京地区黄化萎蔫茄子的病原菌进行了分离与鉴定.结果发现,从茄子黄化萎蔫植株上分离得到了2种病原菌:菌株VW003在PDA培养基上呈黑色圆形轮纹状,分生孢子呈卵圆形,经回接试验确定该菌为引起茄子黄萎病的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae).菌株FW007经培养的气生菌丝呈白色絮状,小型分生孢子团生,卵圆形至椭圆形,大型分生孢子呈镰刀形;接种健康幼苗后也可引起植株黄化、萎蔫和死亡;利用真菌ITS通用引物对菌株FW007的基因组DNA进行PCR扩增,经测序鉴定与GenBank中尖孢镰刀菌菌株的ITS序列(登录号AY928409和JN107739)一致性高达99％,进一步确定菌株FW007为镰刀属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum).以上结果表明大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌均可导致茄子的黄化萎蔫,且分别由这2种病原菌引起的茄子黄萎病和枯萎病通常伴随发生.     

棉花黄萎病拮抗细菌7-30菌株的筛选与鉴定

[目的]筛选大丽轮枝菌的拮抗芽孢细菌,并对其进行生理生化鉴定。[方法]以棉花黄萎病痛原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliag）V-190为测试菌,筛选对其具有拮抗作用的芽孢细菌。通过初筛及复筛,得到1株具有较强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株,并对该菌株进行了形态特征观察和生理生化鉴定。[结果]通过初筛从各地的土样中分离到84株拮抗细菌菌株,再对其中拮抗能力较好的18株进行了复筛,得到抑菌圈达18．9mm的强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株,结合其形态特征和生理生化特征综合考察,初步判断其为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。[结论]获得了大丽轮枝菌的拮抗芽孢细菌7-30菌株。     

特殊生境中植物枯、黄萎病拮抗放线菌的筛选及鉴定

【目的】从特殊生境中分离筛选对植物枯、黄萎病具有较高生防活性的土壤放线菌,为深入开展枯、黄萎病的生物防治提供高效菌株。【方法】用平板稀释法,从采自广西、江苏、陕西等地特殊生境的5份土壤样品中分离放线菌;以西瓜枯萎菌、茄子黄萎菌、棉花枯萎菌作为靶标菌,通过平板对峙法进行初筛和复筛;采用菌丝生长速率法、水琼脂平板法,测定入选菌株发酵液的活性,并对其中拮抗活性高的菌株进行形态特征、培养特征及生理生化特性的分析鉴定,初步确定其分类地位。【结果】从5份采自特殊生境的土壤样品中共分离出53株放线菌,并从中筛选出JSC14、GXW1、GXC1、JSW5、JSW7等5株对所有靶标菌都有明显拮抗效果的菌株,其中JSC14菌株发酵液抑菌作用最强。对5株菌发酵液抑菌活性的测定结果表明,JSC14和GXW1菌株发酵液对供试病原菌菌丝生长和孢子萌发均有强烈的抑制作用,菌丝生长抑制率为62.98%～95.38%,孢子萌发抑制率为69.52%～100.0%。经初步鉴定,菌株JSC14为链霉菌属白孢类群白色亚群白色链霉菌(Streptomyces albus),菌株GXW1为拟诺卡氏菌属链孢拟诺卡氏菌(Nocardiopsis streptosporus)。【结论】获得2株对植物枯、黄萎菌有较高生防活性的土壤放线菌,为进一步探讨利用特殊生境中的放线菌控制土传病害提供了研究材料。     

利用拮抗细菌防治棉花黄萎病

从棉花根围和根内分离到17个供试菌株在平板对峙培养中，都能极显著抑制Verticillium dahliae Kleb(简称Vd）的生长，其中15株的抑菌率大于65％，最高达89．6％。这些菌株的培养滤液也对Vd的生长有抑制作用。对供试细菌的防病及棉花出苗安全性所作的盆栽试验结果表明，13个菌株对棉花出苗表现安全；10个菌株防治棉花黄萎病效果极显著，其中4株（ICB－18、NCD－2、CS－25和CS－27）的防治效果达72．3％0－81．4％；3株（C－94、C－28和NCD－25）的防治效果鬃55．7％－61．9％，而且这7株对棉花出苗都安全。田间试验结果表明，在这7个菌株中，菌株NCD－2能够极显著地防治棉花黄萎病，防治效果为78．1％；另外4株（ICB－18、CS－25、C－94和C－28）能显著降低黄萎病病情指数，防治效果达37．1％－47．3％。     

几种微生物菌剂对连作棉田枯黄萎病的防病效应

为研制和筛选防治新疆连作棉花病害的优良生防菌剂,通过田间小区试验,研究菌根菌(AM)、菌根菌配合滴施1次生防细菌(AM+P1)、菌根菌配合滴施2次生防细菌(AM+P2)、BIO菌肥(B)、重茬菌剂(C)和木霉菌(M)6种菌剂对连作棉花农田枯萎菌、黄萎菌菌源量、防病效果及对土壤养分和棉花产量的影响。结果表明,与对照相比,AM+P1、AM+P2、AM、B、C、M处理土壤中枯萎菌、黄萎菌数量显著降低(P0.05),其中枯萎菌菌落数量分别降低52.5%、65.0%、56.3%、46.3%、33.8%、52.5%,黄萎菌微菌核数量分别降低44.0%、36.2%、42.8%、26.7%、22.2%、42.5%;不同处理下,棉花枯萎病、黄萎病的发病率和病情指数均有不同程度地降低,各菌剂防效可达12.2%~38.8%,依次为AM+P1MAM+P2AMBC。施用菌剂能改善棉田土壤养分,增加速效氮、磷、钾质量分数;M、AM、AM+P1处理可显著增加土壤有机质质量分数。不同处理下,籽棉产量增加2.7~8.1kg/hm2,其中施用木霉菌剂的棉田增产幅度最大,达到38.3%。     

落叶型大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库的构建

采用ATMT技术建立大丽轮枝菌落叶型菌株XJ2008菌株的T-DNA插入突变体文库,共获得6 043个突变体。从中随机挑选104个突变体,以野生型XJ2008菌株为参照,评价其致病性、菌落生长速率、分生孢子及微菌核的产生能力等。结果表明,有12.5%的突变体丧失产孢能力,4.8%的突变体的生长速率显著减慢,8.7%的突变体的生长速率显著加快,12.5%的突变体丧失产生微菌核的能力,47.1%的突变体的致病性显著低于野生型菌株XJ2008,且突变体2-736、2-740、2-745的病情指数分别约为野生型菌株XJ2008的0.184、0.168和0.197倍。该突变体库突变体遗传稳定性好,性状多样性丰富。     

新疆棉花黄萎病菌营养体亲和性研究

１９９６－１９９８年从新疆各主要植棉区采集３０个野生型棉花黄萎病菌菌株,陕西省植保所提供Ｔ－９、ＶＤ－８、安阳菌株及泾阳菌株,经在ＷＡＣ培养基上诱发培养,３４１个突变体,其中１１４个为ＮｉｔＭ,占２６．４５％,３１７个为Ｎｉｔｌ,占７３．５５％。经营养体亲和性配对测试,３２个菌株可分为２个营养亲合群（ＶＣＧｓ）,Ｔ－９与ＶＤ－８属于亲合群Ｉ（ＶＣＧ１）,其余３０个菌株属于亲合群Ⅱ（ＶＣＧ２）,即落     

pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响

微菌核是棉花黄萎病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)在土壤中的主要存活形式及该病的侵染源,研究土壤pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响对明确黄萎病发生具有重要意义。采用菌丝生长速率法研究培养基pH及盐分质量浓度与种类对病原菌生长及微菌核形成的影响。供试大丽轮枝菌菌丝生长最适pH为7.0,偏酸或偏碱会抑制菌丝生长,但培养基偏碱可显著促进微菌核形成。当pH为8.0时,大丽轮枝菌菌丝生长受抑制较小,同时微菌核区面积较pH为7.0时增加22.6%。盐分质量浓度影响大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核形成。随培养基NaCl质量浓度增加,供试大丽轮枝菌生长受到抑制,菌落面积和菌丝面积均逐渐减小,但微菌核形成量却显著增加;当NaCl质量浓度为10g·L~(-1)时,微菌核区面积较无NaCl时增加40.7%。盐分种类影响供试大丽轮枝菌生长。随盐分质量浓度增加,氯化物(NaCl和KCl)和硫酸盐(Na_2SO_4和MgSO_4)均可促进大丽轮枝菌微菌核形成,而CaCl_2则显著促进菌丝生长,并在质量浓度大于7g·L~(-1)时抑制微菌核形成。在培养环境偏碱性或氯化物和硫酸盐含盐量较高时,均可促进棉花黄萎病原大丽轮枝菌微菌核形成量增加。     

5种植物提取物及残体对棉花黄萎病菌的抑制作用

【目的】研究5种植物提取物和残体对大丽轮枝菌的抑制作用,为利用生物熏蒸技术防治棉花黄萎病提供依据。【方法】以棉花黄萎病主要致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)XJ2008菌株为试材,测定韭菜、葱、薄荷、藿香和薰衣草5种植物的甲醇、水提取物,对大丽轮枝菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,并将植物残体以质量分数2%添加到600g基质与田园土的混合样中混匀后,测定植物残体对大丽轮枝菌微菌核萌发的影响。【结果】5种植物提取物均对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用,随着植物提取物质量浓度的增加,抑制作用增强,甲醇提取物的抑菌作用略强于水提取物;韭菜提取物的抑制作用最强,藿香次之。植物残体对大丽轮枝菌微菌核的萌发有明显抑制作用,其中藿香残体的抑制作用最强,薄荷、韭菜次之,薰衣草最弱。【结论】韭菜、藿香对大丽轮枝菌的抑制作用十分明显,有作为生物熏蒸材料的潜力和应用前景。     

尖孢镰刀菌HG-11响应解淀粉芽胞杆菌B501胁迫的机制分析

前期研究发现生防拮抗菌解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B501能够显著抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）HG-11,检测发现B501可以形成生物膜,具备产生纤维素酶和淀粉酶的能力。目前生物防治主要着眼于生防微生物的抑菌机制,而病原菌如何应对生防微生物胁迫的机制却常被忽略,因此旨在利用RNA-seq技术研究HG-11对B501生防胁迫响应的分子机制。结果表明,与对照HG-11样品相比,B501发酵液处理的HG-11样品中共有3 171个基因显著差异表达,其中2 106个基因上调表达,1 065个基因下调表达。上调表达有与细胞壁和细胞膜结构相关的基因如甾醇3-β-葡萄糖基转移酶基因、脂肪酸合成酶基因等,与抗氧化相关的上调表达基因有氧化物酶基因、P-P-键-水解驱动的跨膜转运蛋白基因等,以及与核糖体和线粒体相关的上调表达基因,如核糖体蛋白复合物、异柠檬酸脱氢酶等基因;下调表达的酰基转移酶基因、DNA连接酶基因等均为与细胞修复相关的基因。推测B501的抗菌物质通过破坏细胞壁及细胞膜的结构,并进入细胞内部破坏核糖体和线粒体从而抑制真菌生长。而HG-11通过调节与此相关的多个靶标蛋白或合成途径的基因表达,以缓解B501的生防胁迫作用。初步明确了尖孢镰刀菌应对生防解淀粉芽胞杆菌胁迫的基因表达差异,病原菌的自我防御机制或许是生防菌株易变表现的一个重要因素,提高了对病原菌与生防菌互作结构的认识。     

大丽轮枝菌致病力与寄主棉苗落叶的相关性

以棉花黄萎病菌强致病力菌株Vd084、Vd082和弱致病力菌株Vd001为供试菌株,以耐病品种中棉所35和感病品种冀棉11为鉴别寄主,采用蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液体法,首先明确棉花黄萎病菌致病力与落叶间的关系,然后采用大丽轮枝菌落叶型菌株特异引物D-1/D-2和非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2对供试菌株进行分子检测。结果表明,1×107 mL-1的常规接种量下,3个菌株均能导致棉苗出现落叶;与弱致病力菌株相比,强致病力菌株出现落叶的时间早3d,且落叶株率高。在接种量为1×105~1×107 mL-1,强致病力菌株的落叶株率显著高于弱致病力菌株,当接种量达到1×108 mL-1时,强致病力菌株和弱致病力菌株间差异不明显。3个菌株在耐病品种上的落叶株率(28.8%)显著低于感病品种(37.7%)。分子检测表明,2个强致病力菌株Vd084和Vd082为落叶型菌株,弱致病力菌株Vd001为非落叶型菌株。结果显示,该2对引物检测出的非落叶型菌株Vd001在温室苗期人工接种条件下仍能导致棉苗落叶。可见,对于落叶型棉花黄萎病菌的检测还需要建立更完善的方法,尤其是模拟大田间条件的检测方法更为重要。     

尖孢镰刀菌侵染枸杞根系的转录组分析

由尖孢镰刀菌引起的根腐病是枸杞种植中的主要病害之一,为探究尖孢镰刀菌侵染枸杞的分子致病机制,并挖掘其关键致病基因,通过尖孢镰刀菌侵染‘宁杞1号’枸杞根系,于侵染第7天刮取菌样进行转录组测序分析。结果表明,与纯培养菌株相比,在侵染第7天的尖孢镰刀菌中共发现了1 892个显著差异表达基因,其中上调表达基因1 242个,下调表达基因650个;GO富集分析表明,分子功能分类的跨膜转运蛋白和ATP酶活性以及生物学过程分类的跨膜转运可能在尖孢镰刀菌致病过程中发挥了重要作用;KEGG富集分析表明,鞘脂代谢、过氧化物酶体和ABC转运蛋白是尖孢镰刀菌侵染过程的主要代谢途径。此外,通过对比分析编码碳水化合物酶与植物-病原互作相关基因在尖孢镰刀菌侵染前后的表达量,筛选到10个关键致病候选基因。     

棉田大丽轮枝菌微菌核的空间分布及其抽样技术

大丽轮枝菌可侵染660多中植物,由其引致的黄萎病具有危害性大、难于防治等特点。微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和初侵染源,研究其在土壤中的分布特征及抽样技术,对于准确预测黄萎病的发生为害状况具有重要意义。土壤微菌核调查结果表明,在0~20cm土壤中,微菌核主要呈聚集或均匀分布,随密度而变化。建立的理论抽样数模型为:n=1.467 9(t/D)2 m-1.260 4。利用得到的棉田土壤大丽轮枝菌微菌核调查的序贯抽样模型计算,最多只需抽取35个样点。对各等距机械抽样方法比较后,认为实际中用双对角线取样比较合适,取样数量因土壤中微菌核的密度而异。