精子抗原基因在猪生殖道及成熟精子中的表达特性

【目的】揭示若干精子抗原基因(SPAG1、SPAG5、SPAG6、SPAG11C和SPAG11E)在梅山公母猪生殖道及成熟精子中的mRNA时空表达规律。【方法】利用RT-PCR技术分析各基因在生殖道和精子中组织表达谱,利用半定量RT-PCR分析其在初生至150d梅山公猪睾丸中的发育性表达特性。【结果】5个基因在梅山公母猪生殖道组织中呈现不同的表达特性。其中SPAG1在睾丸中表达丰度最高,在精囊腺、前列腺、附睾体、子宫角和输卵管呈现中等丰度表达,而在附睾尾、子宫颈和卵巢的表达信号较弱。SPAG5在睾丸中表达丰度最高,在前列腺、附睾体和子宫颈中表达信号较弱。而SPAG6在睾丸中高丰度表达,在输卵管中呈现中等丰度表达,在子宫角的表达信号很弱。SPAG11C在附睾体和睾丸中高水平表达,而SPAG11E则在附睾体和附睾尾中低水平表达。在成熟精子中只有SPAG11E有mRNA表达。SPAG1、SPAG5、SPAG6和SPAG11C基因在公猪睾丸中发育性表达分析表明,总体上所检测的4个精子抗原基因的表达水平都随着日龄增加而提高,但存在一些差异。其中SPAG1和SPAG11C呈现相似的表达规律,在初生和30日龄时表达相对较低,但在60、90、150日龄都有显著提高(P0.05)。而SPAG5在初生和30日龄时表达也相对较低,在60和90日龄时均有显著提高(P0.05),但150日龄时略有下降,但差异不显著。SPAG6在初生和30日龄时表达水平很低,至60日龄有显著提高(P0.05),90日龄时维持这一水平,而到150日龄时则有显著下降(P0.05)。【结论】SPAG1、SPAG5、SPAG6、SPAG11C和SPAG11E在梅山公母猪生殖道组织广泛表达,在睾丸组织中其mRNA表达水平变化与性发育相一致,SPAG11E在精子中存在低丰度mRNA表达。     

黄牛、牦牛和犏牛b-Sycp2基因的克隆 与睾丸组织mRNA的表达水平

【目的】克隆黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,了解牛Sycp2基因序列特征和组织表达特征,分析睾丸组织中Sycp2基因的表达水平。【方法】采用电子克隆和克隆测序技术获得黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析牛Sycp2基因的组织表达特征;采用real-time PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Sycp2基因的表达水平。【结果】①黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因编码区序列全长均为4 365 bp,命名为b-Sycp2,编码蛋白含有1 454个氨基酸残基,并包含卷曲螺旋结构域等典型结构域;②b-Sycp2基因在睾丸组织中特异表达,黄牛和牦牛睾丸组织中b-Sycp2基因的表达水平显著高于犏牛（P＜0.05）。【结论】成功克隆了b-Sycp2基因,b-Sycp2基因为睾丸组织的特异表达基因,且黄牛和牦牛睾丸组织b-Sycp2基因表达水平显著高于犏牛。     

牦牛和犏牛DDX25/GRTH基因序列及其在睾丸组织的表达水平

为了解DDX25基因的结构、功能及对犏牛雄性不育的影响。采用RT-PCR技术克隆获得牦牛和犏牛的DDX25基因,对核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析,运用实时荧光定量PCR技术检测睾丸组织DDX25 mRNA的表达情况。结果表明,牦牛和犏牛DDX25基因编码区序列全长均为1 452bp,编码483个氨基酸,氨基酸存在19个磷酸化位点,无信号肽。牦牛睾丸组织DDX25基因表达水平显著高于犏牛,DDX25基因在犏牛睾丸组织的低表达与其雄性不育存在一定关系,该基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因。     

红鳍东方鲀抗苗勒氏管激素(AMH)基因在不同发育时期的组织表达

为研究抗苗勒氏管激素(AMH)基因在红鳍东方鲀Takifugu rubripes各组织和不同发育时期的表达情况以及在性别分化和性腺发育等过程中的作用,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术对红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了amh基因的表达分析以及不同发育时期(23、30、40、60、80日龄及2龄和3龄鱼)红鳍东方鲀个体水平上amh基因的表达分析。结果表明:红鳍东方鲀3龄成鱼脾脏、肾脏和肝脏中的amh基因表达量极显著高于其他组织(P0.01),在精巢和心脏中的表达量极显著高于卵巢和脑(P0.01),其中脾脏中表达量最高,脑中表达量最低;红鳍东方鲀23日龄、30日龄、2龄和3龄鱼中,雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼(P0.01),而60日龄和80日龄时雌鱼表达量显著高于雄鱼(P0.05),40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异(P0.05),3龄时雌、雄个体性腺中amh基因的表达量均显著高于2龄鱼(P0.05);雄性幼鱼amh基因的表达量从23~30日龄呈增长趋势,且在30日龄时达到最高,随后逐渐降低,而雌鱼整体amh基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势,80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。研究表明,amh基因在红鳍东方鲀的性腺发育和性别分化过程中发挥着一定的作用。     

性信息素诱捕斜纹夜蛾雄蛾发育日龄结构的研究

目的 判断性信息素诱捕雄蛾发育状况对于客观评价群集诱杀技术的效果具有重要意义。本文通过斜纹夜蛾（Spodoptera litura）内生殖系统形态与发育日龄的研究,判断田间诱捕雄蛾的发育情况和虫源性质,为应用性信息素诱杀技术防控斜纹夜蛾提供理论依据。方法 2014—2015年,利用昆虫解剖镜对室内羽化1—10日龄斜纹夜蛾雄蛾进行解剖测量,形成依据精巢长半轴判断雄蛾日龄的发育标准;2015—2017年,对四川省眉山市东坡区、四川省成都市金堂县田间利用性信息素诱捕到的斜纹夜蛾进行逐日收集并解剖测定,进而依据该标准划分田间逐日性诱的雄蛾日龄结构,分析诱捕雄蛾对自然交配的影响。结果 斜纹夜蛾雄蛾内生殖系统由精巢、输精管、贮精囊、射精管、附腺组成,精巢结构稳定,具有一定弹性,易测量。随着日龄增长,精巢长半轴数值呈减小趋势,1日龄精巢长半轴均值为1 103.54 μm,10日龄雄蛾精巢长半轴比1日龄长半轴减少44.71%,精巢长半轴（y）与日龄（x）关系式为：y=-48.52x+1084(R ²=0.9472,RMSE=36.8)。1—5日龄组、6—8日龄组、9—10日龄组之间精巢长半轴长度差异显著。根据实验室饲养羽化斜纹夜蛾1—10日龄的精巢长半轴长度与羽化日龄间的数据关系,制定出精巢长半轴判别雄蛾日龄标准表,用于检测田间信息素诱捕雄蛾日龄组成。2015—2017年金堂县和2017年东坡区田间诱捕的雄蛾日龄结构趋势一致,日龄越大,该日龄雄蛾占总诱捕数的百分数越低。金堂县田间诱捕斜纹夜蛾雄蛾1日龄平均百分比为39.89%,2日龄为21.42%,3日龄为15.75%,1—3日龄雄蛾共计占总诱捕数72.22%—79.02%,5—10日龄占比均在10%以下;2017年东坡区田间诱捕斜纹夜蛾雄蛾中1日龄百分比为39.93%,2日龄为20.79%,3日龄为19.54%,1—3日龄雄蛾共计占总诱捕雄蛾数的80.26%,5日龄以后占比较小。各日龄雄蛾平均百分数与日龄数呈指数函数关系下降。根据逐日诱捕雄蛾数量动态,4月末至8月末,金堂县和东坡区斜纹夜蛾均发生3代,第1代、第2代诱捕的雄蛾数以1—3日龄青年蛾为主,金堂青年蛾与老年蛾比为3.32、1.54,东坡区青年蛾与老年蛾比为3.34、1.58;随着虫量增加,第3代东坡区以老龄蛾数量占优势,两者比为0.76,低于金堂的2.34。 结论 斜纹夜蛾雄蛾精巢大小能够反映雄蛾日龄,通过检测田间性诱雄蛾日龄的结果表明,利用性信息素捕获的雄蛾以1—3日龄青年雄蛾为主,有利于降低田间成虫交配率。     

Immunization of Male Mice with a New Recombinant GnRH Fusion Protein Reduces the Testicular Function

The objective of the present study was to evaluate the effect of an immunogenic maltose-binding protein-gonadotropin releasing hormone （GnRH-6-MBP） using genetic engineering. The synthetic mammalian tandem repeated GnRH hexamer gene was inserted into the expression plasmid pMAL-c2x. Recombinant GnRH-6-MBP protein was over- expressed in E.coli strain BL21. Amylose resin with affinity chromatograph was used to purify target protein. The reactiongenicity of fusion protein was identified by indirect enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）, and the antigenicity and biological effects of GnRH-6-MBP were tested in mice. In the experiment, 20 male Kunming white mice of 20 d old were randomly divided into treatment and control group. Ten mice were immunized with 100 μg GnRH-6-MBP administered subcutaneously （s.c.） thrice at 2-week intervals with GnRH-6-MBP. Mice were sacrificed after 3 weeks following the booster injection, the testis was removed, weighed and measured, and the histological structure was observed. The reactiongenicity of fusion protein to GnRH antibody was much higher than the control. Active immunization against GnRH-6-MBP reduced remarkably （P 〈 0.01） the length and weight of the testis, and shortened the girth and width of the testis （P 〈 0.05）, and suppressed testicular spermatogenesis compared to the control mice. These results indicate that the recombinant GnRH-6-MBP acted as a strong immunogen and caused atrophy of the testis.     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

Calendar of gametogenic development in the prepuberal male mouse

The timing of the first meiotic cycle in the young male mouse was established by serial sacrifices and subsequent paraffin sectioning of testis and epididymis. Meiosis commences in mice 8 to 10 days old. The highest frequency of any one phase of meiosis was found at days 17 to 19, when 47 percent of the tubules were found to contain late pachytene.     

皖南花公猪性腺生长发育的研究

研究皖南花公猪性腺生长发育规律表明,睾丸重量在出生时为０．４３－０．５０g,２４０日龄之后达到９２．３３－９７．７５g;附睾重量在４５日龄时为１．１２g,２４０日龄达到３４．５０g;睾本积(y)随日龄（x)的生长可以用模型y＝a bx cx^2来描述,其中a、b和c为模型参数。前列腺、精囊腺和尿道球腺重量在出生时分别为０．２１、０．１３和０．２６g,２４０日龄后分别达到８．２７、１８２．００和１５３．８３g;副性腺的生长呈出现指数生长模式。公猪性腺的生长发育与血浆中生长激素和睾酮的水平具有明显的正相关。     

外源褪黑激素对水貂睾丸形态及组织学结构的影响

为研究外源褪黑激素(Melatonin,MT)对水貂睾丸形态及组织学结构的影响,选择30只50日龄健康雄性短毛黑水貂,随机分为A、B两组,每组15只,组间体重差异不显著(P>0.05).2010年7月15日,A组每只水貂颈后部皮下埋植MT 10 mg·只-1,B组未进行任何处理.作为对照组,饲养期为108 d.10月30日,A组水貂取皮后摘取睾丸,同时剖取3只对照组水貂睾丸,所取睾丸称重后用10%中性福尔马林固定、石蜡切片、H.E染色、光学显微镜观察.结果表明,MT组水貂取皮期单侧睾丸平均重量极显著高于对照组(P<0.01);与对照组相比,MT组水貂取皮期睾丸生精小管内细胞层数和种类较多,而对照组生精小管内细胞疏松,仅见少量精原细胞,且MT组生精小管直径、附睾管与管腔直径及附睾上皮厚度极显著高于对照组(P<0.01).为褪黑激素对水貂性腺组织学影响的深入研究提供基础资料.     

鳜雌雄表型差异及性别相关标记筛选

为了解鳜(Siniperca chuatsi)雌雄性别表型差异,测量120日龄养殖鳜的体重及主要形态性状,雄性平均体质量(396.52±74.81)g,雌性平均体质量(442.17±54.02)g,雌性比雄性增长快10.32%;雄性头长/头高比显著大于雌性;雌性体长/体高比极显著大于雄性。通过组织学观察孵化后5～60日龄鳜性腺发育分化过程,25日龄前,性腺未分化,30日龄精巢分化,40日龄卵巢分化,精巢分化早于卵巢。利用AFLP技术筛选鳜雌雄性别相关分子标记,在4个引物组合E5M8、E1M8、E6M7、E7M3中筛选出5个雌雄差异位点,其中,E5M8-480在雄性中扩增比例为91.67%,E1M8-440和E5M8-370在雌性中比例分别为91.67%和83.33%,E6M7-280和E7M3-380为雌性特有条带。研究结果为鳜雌雄性别异形与性别鉴定提供了基础和依据。     

公猪睾丸生长与初情期关系研究

用动态方法研究睾丸的生长规律，并用Ｇｏｍｐｅｒｔｚ等模型模拟建立了二花脸猪睾丸生长模型。通过估测，其拐点日龄、拐点重量、瞬时相对生长率、最大日增重参数分别为：７９ｄ、３１．９６ｇ、０．０２２和０．７０ｇ。睾丸的拐点日龄和公猪的初情期接近（Ｐ＜０．０５）。     

团头鲂SPATA4基因的分子克隆及表达分析

采用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术从团头鲂精巢中克隆出精子发生相关基因4（spermatogenesis associated gene 4,SPATA4）。该基因cDNA全长为1 076 bp,包括1个678 bp的完整阅读框架,编码225个氨基酸,预测的氨基酸序列的分子质量为25.72 ku,等电点为9.32。序列分析显示团头鲂SPATA4基因与其他脊椎动物同源性较高。荧光定量PCR结果显示SPATA4基因在受精后1～206 h期间,该基因在受精后4 h和受精后28 h的表达量最高,在受精后50 h表达量最低,而在其他时期的表达水平基本一致;在所检测的10个组织中,SPATA4基因在精巢中的表达量最高。     

黄鳝性逆转相关基因的克隆和表达

运用cDNA末端快速扩增(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE)技术和半定量RT-PCR技术,克隆了黄鳝(Monopterus albus)性腺差异表达基因(F64)的cDNA全长序列,分析了该基因于各期性腺组织的表达情况。结果表明,F64基因cDNA全长1 721 bp,含有142 bp的5’-UTR、268 bp的3’-UTR、1 311 bp的开放阅读框(ORF),共编码436个氨基酸;在线SignalP分析表明,F64亚基肽链不存在信号肽,为非经典分泌蛋白;同源性分析结果显示该基因无同源性序列,视为新报道的基因;F64在卵巢发育早期不表达,从排卵的Ⅴ期卵巢开始表达,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。     

母源因子boule在光棘球海胆性腺中的表达与定位

为鉴定光棘球海胆Mesocentrotus nudus生殖细胞标记基因,通过基因克隆、荧光定量PCR及切片原位杂交等技术分析了光棘球海胆(湿体质量为76.8 g±10.0 g)母源因子(boule)基因的分子特征及动态表达模式。结果表明:光棘球海胆boule cDNA序列全长为1788 bp,其中,3′非编码区为601 bp,5′非编码区为146 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1041 bp,共编码346个氨基酸,包含一个保守的RRM结构域;荧光定量PCR结果显示,boule为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达;boule基因在处于生长期(stageⅡ)光棘球海胆的肠、管足、体腔液和性腺中均有表达,其中,boule基因在精巢表达量最高(P<0.05);在卵巢中表达量随卵母细胞的成熟而逐渐升高,在成熟期(stageⅣ)卵巢中达到最高,精巢中表达量仅在生长期(stageⅡ)及成熟前期(stageⅢ)有较高表达;切片原位杂交显示,boule基因在光棘球海胆精巢的生殖细胞中特异表达,卵巢中未检测到阳性细胞信号。研究表明,光棘球海胆boule基因是雄性生殖细胞标记基因,本研究结果可为海胆雄性生殖细胞发育相关研究提供数据资料。     

玻璃扯旗鱼性别特征及其幼鱼性别分化的组织学初探

应用形态学、解剖学及组织学方法对玻璃扯旗鱼的性别特征及其幼鱼性别分化基本过程进行研究。结果显示:在6月龄玻璃扯旗雌鱼卵巢中能观察到各时相的卵母细胞,在雄鱼精小管管腔内有大量精子;4月龄以上玻璃扯旗雌鱼的腹部隆起,并有淡黄色颗粒状组织,而雄鱼无类似结构;100日龄以上雌鱼的臀鳍有钩状小齿,但2月龄前的幼鱼无该组织。5~50日龄幼鱼性腺发育状态显示:10日龄以下幼鱼的体内无分化明显的生殖腺;15日龄幼鱼体内有生殖包囊,且15日龄之前仅在腹腔一侧可观察到性腺组织,而25日龄幼鱼的腹腔两侧均有对称分布的类卵巢结构;至30日龄时,部分幼鱼可观察到有棒状精巢,性腺开始分化。本研究中探明了玻璃扯旗鱼性别分化及性腺发育的关键时间节点,该结果可为进一步研究其分子调控机制提供参考。     

家禽piRNAs(PIWI-interacting RNA)的研究进展

piRNA是一类新型的非编码小分子RNA,与PIWI蛋白相互作用,称为piRNA(PIWI-interacting RNA),长度约26～32个核苷酸,其作用与Dicer酶无关。在生殖细胞的发育、转座子沉默、减数分裂和精子发生等过程中,piRNA具有多种生物学功能。文中综述了近年来禽类在piRNA方面的研究进展。     

睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒生产转基因兔的研究(英文)

为探讨直接用注射器对睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒转染兔的精子细胞和卵母细胞,建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性。选择5只成年新西兰雄兔、29只经产新西兰雌兔,每侧睾丸和卵巢内分别打点注射0.5~0.8 mg/mL质粒0.25 mL。①第3周随机取一只雄兔睾丸做冰冻切片,于荧光显微镜下观察转染情况。②(Ⅰ:1#♂×7♀、Ⅱ:2#♂×7♀、Ⅲ:3#♂×7♀、Ⅳ:4#♂×7♀)其它雄兔于第6周和第7周与3日前做过卵巢注射并超排处理的雌兔配种,最后采集新生仔兔耳组织,提取基因组DNA,经PCR和Southern杂交检测阳性率。结果显示雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下可见绿色荧光,统计所得后代转基因阳性率,并进行差异分析,其中Ⅰ组后代阳性率最高,PCR和Southern杂交检测阳性率为93.55%和83.87%,Ⅳ后代阳性率最低,依次为80.65%和70.97%,但是各组之间差异不显著。上述实验结果表明,对睾丸和卵巢同时注射外源基因可获得较高阳性率的转基因后代,生产转基因的方法操作简便、高效,为日后大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用，利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长，使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异，运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp，其中5''非编码区长93 bp，3''非编码区长447 bp，开放阅读框（ORF区）长1 821 bp，编码606个氨基酸；qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达；早期发育阶段在6月龄时表达量最高；12、24、36月龄的表达结果显示，KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时，设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链，结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因，其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

液态甲醛对雄性小鼠生殖系统的毒性作用研究

为探讨液态甲醛对雄性小鼠生殖细胞的毒性和致突变作用,选用雄性昆明种小鼠为研究对象,进行液态甲醛腹腔染毒,7 d后测定睾丸脏器系数、精子数目、精子形态及精子畸形率及精子微核率。结果表明:中、高剂量组(2.0、20.0 mg/kg)甲醛具有明显的生殖毒性,小鼠睾丸指数、精子数量明显降低,小鼠精子存活率、活动率都受到显著影响;中、高剂量组的精子畸形率、微核率与阴性对照组比较,有显著性差异。由此说明,液态甲醛对雄性小鼠的生殖细胞具有明显的毒性和致突变作用。