神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素（In）、胰高血糖素（GLN）、瘦素（LEP）和代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）、葡萄糖（GLU）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）法观察了神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In、NEFA、BHBA和GLU的升高，GI。NRmRNA表达逐渐增加（P〈0．01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNRmRNA表达逐渐降低（P〈0．01）；而随着培养液中瘦素浓度的升高，GLNRmRNA的表达呈先升高后降低的趋势（P〈0．01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP和代谢产物NEFA、BHBA、GLU直接调控新生犊牛肝细胞GLNRIT／RNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体(GLNR)mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中胰岛素质量浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐增加(P<0.05);而随着培养液中胰高血糖素浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐降低(P<0.01)。本研究结果表明,胰岛素、胰高血糖素直接调控奶牛脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA的表达。     

瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素（Leptin）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（p〈0.01）;研究结果表明瘦素直接调控奶牛肝胰高血糖受体mRNA的表达。     

瘦素对体外培养新生犊牛脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素在奶牛脂肪代谢中的调控作用,应用荧光定量RT-PCR法观察了瘦素对体外单层原代培养脂肪细胞胰高血糖素受体(glucagon receptor,GLNR)mRNA丰度的影响。结果表明:随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的丰度呈现先升高后降低的趋势(P<0.01),瘦素对GLNR mRNA的表达具有双重作用;研究结果表明,瘦素直接调控新生犊牛脂肪细胞GLNR mRNA的表达。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）和葡萄糖（GLU）在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果，随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高，GLNRmRNA的表达量逐渐增加（P〈0．01）。表明，代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素和神经肽Y对体外培养犊牛肝细胞硬脂酰CoA去饱和酶mRNA表达的影响

在应用实时荧光定量PCR法观察胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、神经肽(NPY)对体外培养新生犊牛肝细胞硬脂酰CoA去饱和酶(Stearoyl CoA desaturase,SCD) mRNA丰度的影响.结果显示,随着培养液中In含量的升高,肝细胞中的SCD mRNA表达逐渐升高(P＜0.05),呈现明显的剂量依赖促进效应;随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞SCD mRNA丰度表达逐渐减弱,高血糖素处理组SCD mRNA表达均极显著低于对照组(P＜0.01);而随着NPY质量浓度在0～1 000 ng/L之间逐渐上升,肝细胞SCDmRNA的表达水平不断升高,各处理组显著高于对照组,除50 ng/L处理组和500 ng/L处理组之间差异不显著外,其他处理组之间差异显著(P＜0.05).结果表明,胰岛素和神经肽Y促进SCD mRNA表达,胰高血糖素抑制SCD mRNA表达.     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明神经内分泌因子在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白,采用内对照RT-PCR方法检测神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)mRNA丰度的影响。结果显示,随着细胞培养液中胰岛素和胰高血糖素浓度升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性下降(P<0.01);随着瘦蛋白浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。这表明胰岛素和胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,呈现剂量依赖性;瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA表达具有低剂量促进而高剂量抑制的双重作用,且均呈现剂量依赖性。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养肝细胞DGAT2mRNA的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢过程中的调控作用,用荧光定量PCR方法检测胰岛素、胰高血糖素对肝细胞二酰基甘油酰基转移酶（DGAT2）mRNA丰度的影响。结果表明低浓度的胰岛素能促进脂肝细胞内DGAT2mRNA的表达;胰高血糖素抑制脂肝细胞内DGAT2mRNA表达。由此证明：胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中的DGAT2基因mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞CPT-Ⅰ和CPT-ⅡmRNA表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加不同浓度的胰岛素（insulin,INS）（0、1、10、100、1 000nmol/L）和胰高血糖素（glucagon,GLN）（0、1、10、100、1 000nmol/L）,每个处理做3个重复,分别培养1h后,提取总RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法,检测肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅰ）和肉碱棕榈酸转移酶Ⅱ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅱ）mRNA表达的变化。结果显示,随着培养液中INS含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量逐渐降低,呈现一定的剂量依赖性。随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量均升高,呈现一定的剂量依赖性,且当GLN的添加浓度高于100nmol/L时,CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量显著升高（P〈0.01）。结果表明,INS可在一定程度上抑制脂氧化关键酶的表达,GLN可显著促进脂氧化关键酶的表达。     

INS、GLN和LP对体外培养牛脂肪细胞内HSL、LP的mRNA丰度的影响

为了阐明胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLN）和瘦蛋白（LP）对牛脂肪细胞内激素敏感酯酶（HSL）、LP的mRNA表达的调控作用，本试验采用体外原代培养牛脂肪细胞的培养液中添加不同浓度的胰岛素（0、5、10、20、50、100mmol／L）、胰高血糖素（O、25、100、200、500、1000pg／mL）和瘦蛋白（O、2．5、5、10、50、100ng／mL），培养12h后，应用建立的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法检测牛脂肪细胞内HSL、LP的mRNA丰度。结果表明：胰岛素对牛脂肪细胞内HSL的mRNA表达呈现剂量依赖性抑制作用，对LP的mRNA表达呈现剂量依赖性促进作用。胰高血糖素对牛脂肪细胞内HSL的mRNA表达呈现剂量依赖性促进作用，对牛脂肪细胞内LP的mRNA表达无作用。瘦蛋白对牛脂肪细胞内HSL的mRNA表达先呈现剂量依赖性促进作用，后呈现抑制作用。但对牛脂肪细胞内LP的mRNA表达呈现剂量依赖性抑制作用。     

生糖底物和神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA表达水平的影响

在原代单层培养的新生犊牛肝细胞培养液中分别加入不同浓度丙酸钠、丙酮酸钠、胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白，培养12h后，应用半定量RT-PCR方法检测体外培养的肝细胞PEPCK—C mRNA的丰度。结果显示，随着丙酸钠、丙酮酸钠浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度均先升高后下降（P〈0．01）；随胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度分别剂量依赖性地降低、升高（P〈0．01）和无显著变化。表明，丙酸钠、丙酮酸钠能通过上调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而促进肝糖异生代谢，但上调作用是有限的；胰岛素能通过下调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而抑制肝糖异生代谢，且下调作用呈剂量依赖性；胰高血糖素与胰岛素作用刚好相反；瘦蛋白未起直接的调节作用。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞FAS mRNA表达的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素与脂肪酸合成酶（FAS）的关系,在体外培养良好的脂肪细胞中添加不同浓度的胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLU）,每个激素设置6个浓度梯度,培养12h后,通过荧光定量PCR技术,观测胰岛素、胰高血糖素对FAS mRNA丰度的影响。结果显示,胰岛素促进了FAS mRNA的表达,而胰高血糖素抑制了FAS mRNA的表达。结果表明,胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中FAS mRNA的表达。     

Hormonal regulation of leptin receptor expression in primary cultures of porcine hepatocytes

A study was conducted to elucidate hormonal control of leptin receptor gene expression in primary cultures of porcine hepatocytes. Hepatocytes were isolated from pigs (52 kg) and seeded into collagen-coated T-25 flasks. Monolayer cultures were established in medium containing fetal bovine serum for 1 day and switched to a serum-free medium for the remainder of the 3-day culture period. To establish basal conditions hepatocytes were maintained in serum-free William's E medium containing 10 nM dexamethasone and 1 ng/ml insulin. For the final 24 h, insulin (1 or 100 ng/ml) or glucagon (100 ng/ml), were added in the presence or absence of 100 nM triiodothyronine (T3). RNA was extracted and quantitative RT-PCR was performed with primers specific for the long form and total porcine leptin receptors. Leptin receptor expression was calculated relative to co-amplified 18S rRNA. Expression of the long form of the leptin receptor was confirmed under basal conditions. Insulin, glucagon and synthetic human proteins (ghrelin and GLP-1) at 100 ng/ml had no influence on leptin receptor expression; the addition of T3 was associated with a marked increase (P < 0.001) in expression of total and long forms of the leptin receptor by 1.6 and 2.4-fold, respectively. Addition of leptin to cells which were pre-treated with T3 for 24 h (to up-regulate leptin receptor expression), confirmed the lack of a direct effect of leptin on glucagon-induced glycogen turnover and cAMP production. These data suggest that porcine hepatocytes may be insensitive to leptin stimulation even when leptin receptor expression is enhanced by T3.     

非酯化脂肪酸对体外培养犊牛原代肝细胞中炎性因子表达及其活性的影响

在建立犊牛原代肝细胞体外培养模型的基础上，通过培养液中添加不同浓度的非酯化脂肪酸（Nonesterifiedfatty acids，NEFAs），运用实时荧光定量PCR和ELISA方法，测定NEFAs对肝细胞中炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达及其活性的影响。结果显示，NEFAs作用肝细胞9h后，与对照组相比，高浓度NEFAs（1．8mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β的mRNA表达水平显著增加（P〈0．05），IL-6的mRNA表达水平在2．4retool／L时极显著增加（P〈0．01），低浓度NEFAs（0．6、1．2mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平无显著差异（P〉0．05）；并且TNFα、IL-1G的活性在NEFAs浓度达到1．8、2．4mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），且呈剂量依赖性作用，IL-6的活性在在NEFAs浓度达到1．8mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），在2．4mmol／L也高于对照组，但差异不显著。结果表明，高浓度NEFAs在-定程度上能引起或加剧奶牛肝细胞炎性反应，可能是导致产后奶牛肝功能炎性损伤主要因素。