tac启动子碱基突变对睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)降解能力的影响

应用PCR技术将发生突变的tac启动子-10区（TATGTT）回复突变为TATATT和TATGAT,构建了两个重组质粒pPM1、pPM2,酶切结果发现pPM1质粒转化大肠杆菌后部分细菌对tac启动子进行切除。将重组质粒分别与pAX1共转化大肠杆菌,提取细菌总蛋白,酶联免疫吸附法测定细菌总蛋白中activator及3α-HSD的表达量,结果表明tac启动子-10保守区为TATATT的质粒比-10保守区为TATGAT的质粒具有更高的转录活性,activator及3α-HSD的表达量高低依次均为pPM1＞pPM2＞pb。根据同源重组原理构建突变菌,并利用HPLC测定了各突变菌对睾凡酮的降解能力,结果表明不同突变菌对睾凡酮的降解能力高低依次为Cp7（C.T.+ pPM1）> Cp4（C.T.+pPM2）> Cb7（C.T.+pb）>C.T.。     

牛肌细胞生成素基因(MyoG)启动子的活性及组织特异性分析

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用。为了研究牛(Bos)MyoG基因启动子的启动效率和组织特异性。本研究首先克隆了牛MyoG基因启动子区域,以pDsRed2载体为外源载体,红色荧光蛋白为目的基因,构建了pDsRed-BosMyoG真核表达载体。利用脂质体介导转染体外培养的绵羊(Ovis aries)骨骼肌卫星细胞和成纤维细胞,最后通过实时定量PCR和Western blot检测红色荧光蛋白的表达,从而确定牛MyoG基因启动子的启动效率及组织特异性。结果显示,pDsRed-BosMyoG转染绵羊骨骼肌卫星细胞后在显微镜下可观察到红色荧光蛋白的表达,但在转染后的成纤维细胞中并没有观察到红色荧光蛋白的表达。在mRNA水平上,转基因骨骼肌卫星细胞中红色荧光蛋白mRNA表达量明显高于转基因成纤维细胞(P0.01)。Western blot结果显示,转基因骨骼肌卫星中高表达红色荧光蛋白,而在转基因成纤维细胞中并未检测到此蛋白。结果表明,本研究克隆得到的牛MyoG基因启动子可以特异性的在绵羊骨骼肌卫星细胞中驱动外源基因的高表达,是一种有效的肌肉细胞特异性启动子。克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为改良家畜肉质研究提供实验依据。     

大白菜ABCB/PGP基因家族的鉴定与分析

ABCB/PGP蛋白为ABC转运蛋白的一个亚家族,能够参与植物中生长素的极性运输,在植物生长发育过程中具有重要作用.为深入认识大白菜ABCB/PGP基因家族,利用生物信息学方法对大白菜中ABCB/PGP基因家族成员进行了全基因组水平鉴定,并对其基因组信息、蛋白质生理生化特征、基因结构和系统进化等方面进行研究.结果表明,...     

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。     

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因(ahyR)突变株的构建及特性分析

根据GenBank公布的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)转录调控蛋白基因ahyR序列设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR的部分片段。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kanr)基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。将鉴定为阳性的重组质粒转化嗜水气单胞菌J-1株感受态细胞,获得1突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因同源突变株,命名为J-1△ahyR。与J-1株相比,突变株的外膜蛋白图谱和部分生化特性发生改变;胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素等几种主要毒力因子同时丧失;致病力明显降低,对小白鼠的半数致死量大于1.0×108CFU(colonyformingunits)。该研究为ahyR基因功能的探讨及嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。     

拟南芥AtEXPA1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

扩张蛋白(expansin)是一类特异定位在细胞壁上具有酸生长活性的蛋白(Lee and Kende,2001;Chen and Bradford,2000),调控很多重要的生理过程(Cho and Cosgrove,2000),在时间和空间上的表达受到严格调控.本研究克隆了一个拟南芥expansin基因AtEXPAl的启动子,通过数种逆境胁迫诱导表达,对可能的活性响应部位进行了分析.     

斑鳜myostatin基因及其启动子的克隆与序列分析

采用Tail-PCR和常规PCR技术首次克隆出斑鳜myostatin基因及其启动子序列。经生物信息学分析发现,斑鳜myostatin基因由3个外显子和2个内含子组成,编码区1131bp,共编码376个氨基酸。斑鳜myostatin启动子区域大小为840bp,存在1个TATAA-box、4个E-box和1个CAAT-box作用元件。利用软件CLUSTALW和MEGA3.1构建14种硬骨鱼的myostatin启动子的系统进化树结果表明：斑鳜同大口黑鲈亲缘关系最近,与鲤鱼和缨野鲮亲缘关系较远,其结果与传统形态学分类中的亲缘关系一致。斑鳜myostatin基因及其启动子克隆与特征分析,将为进一步研究鱼类myostatin基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

甘蓝型油菜SAMDC3基因及其启动子的克隆与分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是植物体内亚精胺和精胺前体物质形成的关键酶。本研究克隆了甘蓝型油菜（Brassica napus）BnSA MDC3基因家族2个成员的全长cDNA和启动子序列,并对其诱导表达特性进行了鉴定。BnSAMDC3—1（GenBank accession No．HM013966）和BnSAMDC3—2（GenBankac．cession No．HM013967）的全长cDNA分别为1746bp和1754bp,开放阅读框（ORF）长度分别为1101bp和1104bp,在大ORF上游132bp处均包含一个171bp的小ORF。BnSAMDC3基因在叶片中表达量较高,受高温和干旱抑制。6-BA、GA,和SA抑制BnSAMDC3—1的表达,而GA,和甘露醇诱导BnSAMDC3—2表达上调。BnSAMDC3基因启动子具有多个与胁迫和激素诱导相关的顺势调控元件,表明BnSAMDC3可能通过ABA、6-BA和SA信号途径介导植物对非生物胁迫的响应。本研究将有助于进一步探讨甘蓝型油菜抗逆的分子机理,为甘蓝型油菜的栽培和品质改良奠定基础。     

小金海棠类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)启动子的克隆与表达

为探明小金海棠(Mdus xiaojinensis)类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)的表达和调控机制,应用Tail-PCR技术从小金海棠中克隆了翻译起始位点上游891 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件、乙烯应答元件、赤霉素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件.以GFP为报告基因,构建了含MxYSL5基因启动子的植物表达载体MxYP5-GFP.将MxYP5-GFP用基因枪法转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,瞬时表达结果表明,该启动子能够驱动GFP在洋葱表皮细胞中的表达,可以用于MxYSL5的表达示踪.     

大白菜花蕾败育相关基因的cDNA-AFLP差异表达分析

本研究以大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis(Lour.)Olsson)败育花蕾到正常花蕾的10个连续时期的花蕾为材料,采用cDNA-AFLP技术和生物信息学分析等方法研究了败蕾过程中的基因表达差异,获得了192个大白菜败蕾相关差异表达片段,随机挑选88个序列进行测序,获得72个新表达序列标签(ESTs),将长度大于100 bp的67个ESTs在GenBank进行了登录,登录号为GR308155-GR308221.根据生物信息学分析结果,其中Blastx比对分值大于80的62条ESTs可分为能量和新陈代谢、膜和运输、转录和翻译、氨基酸合成和加工、信号传导、防御及分类不确定7类.其中EST46、EST3-1、EST13-2、EST20-1和EST30-2等5个ESTs为大白菜花蕾败育材料中新发现的.     

拟南芥AtEXP1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。     

花生ARAhPR10基因启动子序列的克隆及分析

PR10（pathogenesis-related class10protein）类蛋白与植物的抵御外来病害及系统获得性抗性（SAR）有着紧密联系,本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗黄曲霉花生品种粤油20中克隆ARAhPR10（Aspergillus flavus-resistant AhPR10）基因起始密码子ATG上游256bp类似启动子序列,并对其进行植物顺式作用元件数据库PLACE预测分析。结果表明,该类似启动子序列含有4处TATA box和2处CAAT box保守的启动子结构元件,还有6处W-box、1处BIHD1和3处GT-1motif抗逆应答元件,其中W-box常见于PR蛋白的启动子区内参与病程应答。我们初步认为本研究克隆的序列可能是ARAhPR10基因的启动子。     

水稻rbcs基因启动子的克隆及结构功能分析

利用PCR法克隆了水稻日本晴来源的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因（rbcS）5’上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶鞘、茎杆及颖壳中特异性表达，在胚乳中不表达。然后构建不同长度片断的Posrbcs的5’端缺失体，分别与gus构建融合基因，转入水稻中。对转基因植株GUS活性定量分析结果显示， Posrbcs片段愈短，GUS活性愈低；进一步的光诱导试验结果显示，光能明显提高gus基因表达活性，并且随着Posrbcs片段缩短，Posrbcs中的I box、GT1结合位点、GATA box、T box 等光诱导相关元件的缺失会造成在不同时间段的光诱导活性降低以及光诱导表达时间后移。凝胶阻滞试验证实Posrbcs序列中的这些光诱导相关元件有相应的核蛋白的结合。     

烟草NtMTPC4启动子的克隆与缺失分析

组织特异性启动子是基因工程研究及实际应用中的重要工具。为了研究烟草NtMTPC4启动子的表达特性,采用实时荧光定量PCR方法分析烟草金属耐受蛋白C4(MTPC4)基因NtMTPC4在烟草不同组织中的表达模式,并利用PCR技术克隆得到NtMTPC4的上游启动子NtMTPC4-P。根据调控元件的分布对NtMTPC4-P进行不同程度的缺失,获得了NtMTPC4-P1、NtMTPC4-P2和NtMTPC4-P3缺失体;构建全长NtMTPC4-P和不同缺失体的植物表达载体,并通过花序浸染法转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析。结果表明,NtMTPC4基因的表达具有组织特异性,其在花中的表达量最高。NtMTPC4-P全长2 287 bp,含有CAAT-box、TATA-box、GTGANTG10和POLLEN1LELAT52等顺式作用元件和调控元件。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子NtMTPC4-P和不同缺失体都能特异性地驱动GUS基因在转基因拟南芥花粉中的表达。本研究结果为通过基因工程技术在花粉中特异表达目的基因提供了新的调控元件。     

猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)启动子克隆及其分析

本研究旨在对猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)的转录调控机制进行初步探讨.首先通过PCR方法扩增MC4R基因5’上游启动区l 234 bp(-1 264～-31 bp)的片段,再利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,最后采用步移缺失获得了11段长度不等的启动子片段,并分别克隆到荧光素酶(LUC)报告基因表达质粒(pGL3-Basic)中.同时,通过双荧光素酶报告活性分析检测MC4R基因启动子区不同长度片段在猪上皮型肾细胞(PK15)中瞬时转染后的活性.结果表明,猪MC4R 5’端-682 bp处存在1个潜在的转录起始位点(TSS),细胞检测结果显示-514～-486bp区域内存在控制MC4R基础转录活性的顺式调控元件,推测该序列内的热休克转录因子(HSF)结合位点可能对MC4R基因的表达调控及功能行使具有重要作用.     

苦瓜Ⅲ型过氧化物酶Prxs基因及其启动子的克隆与表达分析

过氧化还原蛋白(Prxs)是广泛存在于植物体内重要的抗氧化酶。为深入研究Prx基因在苦瓜非生物胁迫中的作用,从苦瓜叶片均一化文库中获得McPrx基因的cDNA全长序列,并命名为McPrx(KJ722768.1),该cDNA序列全长1 068 bp,开放阅读框972 bp,编码324个氨基酸,属于ClassⅢ基因家族成员。采用基因组步移法分离获得McPrx基因5'上游1 237 bp的启动子调控序列,运用Plant CARE对其进行顺式作用元件分析,结果显示该序列除含有CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件,还具有激素、抗病与抗逆应答元件,表明McPrx基因的表达可能受多种外界环境条件的调控。qRT-PCR分析表明,McPrx在根、茎、雌花等器官中的表达量存在极显著差异。其中在茎中表达量最大,在雌花中表达量最低,说明该基因的表达具有器官表达特异性;低温胁迫1 h时,McPrx表达量显著上调,胁迫3 h时McPrx表达量达到最大,随后下降,说明McPrx响应了低温胁迫的应答。本研究结果为进一步研究McPrx的生物学功能及其应用奠定了基础。