不同鳞翅目昆虫细胞色素P450基因(CYPs)的比较基因组学分析

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)涉及许多昆虫生理功能,包括对信号分子的代谢、宿主植物的适应性及杀虫剂的抗性等.鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的种类仅次于鞘翅目(Coleoptera),包含了大量的农业害虫.根据鳞翅目烟草天蛾(Manduca sexta L.)的基因组数据,开展CYPs的全基因组学分析,在该基因组中发现了110个可能的CYPs,可分为29个家族,其中有大量CYPs以串联重复形式排列.将分析所得序列与蝶类昆虫黑脉金斑蝶(Danaus plexippus L.)和模式昆虫家蚕(Bombyx mori L.)的CYPs进行比较基因组学分析,结果表明,在CYP2与线粒体集团(clan)中存在12对CYPs直向同源基因,而CYP3与CYP4集团的CYPs呈现种属特异性扩增趋势.通过比较分析鳞翅目昆虫与其他非鳞翅目昆虫的CYPs发现,鳞翅目昆虫之间不仅存在更多的直向同源基因对,而且鉴别出的直向同源基因群也更多,但出现新的家族与亚家族数量相对较少.不同鳞翅目昆虫基因组中的CYPs存在相当广泛的线性保守现象.这些不同昆虫间的比较基因组学分析将促进鳞翅目昆虫CYPs的研究,也有助于害虫治理新靶标的选择.     

生物细胞色素P450的研究进展

简要介绍了生物细胞色素P450分布的多样性、P450的功能、P450在不同领域的研究现状与进展。鉴于P450的研究无论在理论上探索生物的生理代谢、选择进化和 生物与环境的关系方面，或在环境保护、农业生态、生物防治、作物基础工程和医药卫生等应用方面，都有广泛的实践意义，因此，应该受到更大的关注和重视。     

砀山酥梨细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450在植物的苯丙烷类、生物碱和萜类等生物合成中起着非常重要的作用。为了更好地了解砀山酥梨中P450的种类和数量,利用砀山酥梨基因组的氨基酸和c DNA数据库对P450基因进行筛选,分析砀山酥梨全基因组中P450基因的种类、进化关系、基因的物理定位、以及二级结构元件。结果显示,在砀山酥梨基因组中发现并初步确定了226个P450基因,通过基因的定位分析确定了226个基因分布在17条染色体上,其中除了4、5、9号染色体上无基因簇分布外,其他的染色体都有基因簇的分布。通过基因结构和进化树之间的比较,进一步确定了基因结构和进化之间的相互联系。二级结构的分析表明,砀山酥梨P450蛋白序列同样具有P450蛋白特征性结构域。本研究结果为砀山酥梨P450基因功能的深入分析奠定了基础。     

油菜叶片衰老相关基因的分离细胞色素P450 cDNA的克隆和序列分析

通过绿叶和衰老叶片cDNA的缩减杂交和差别筛选,富集并分离了缩减cDNA文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段.以目的基因片段为探针,通过筛选油菜衰老叶片的cDNA文库,分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长cDNA LSC46.DNA序列分析结果表明,LSC46可读框架全长由1509个碱基组成,可以编码503个氨基酸残基,它的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与拟南芥菜依赖于单加氧酶的细胞色素P450的相应序列相比,分别有84.23%和83.50%的同源性.     

茶树脱水素基因(CsDHN)的克隆及表达分析

脱水素(dehydrins,DHNs)是植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)中的一类,与低温、干旱以及盐胁迫等多种逆境反应相关.本研究采用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA ends,RACE)技术从茶树(Camellia sinensis)中获得一种茶树脱水素基因CsDHN (GenBank登录号:FJ436978),序列分析显示,该基因cDNA全长960 bp,编码201个氨基酸,推测编码蛋白质分子量约为21kD,等电点为8.3,属于Y3SK2型脱水素.CsDHN基因有2个外显子和1个内含子.生物信息学预测显示,该脱水素蛋白亲水性强、无信号肽和跨膜区,亚细胞定位于细胞质中.表达特性分析表明,CsDHN在逆境及脱落酸(abscisic acid,ABA)诱导下可上调其转录水平,4℃低温处理下表达量可提高4.2倍,而脱水处理能提高93.4倍,高盐处理能提高17.8倍,CsDHN对脱水、高盐胁迫的响应程度优于低温胁迫.CsDHN在茶树各组织器官中都有表达,其中种子中表达量最高,为叶片的11.2倍.研究表明脱水素基因CsDHN可能在茶树防御非生物逆境胁迫和参与茶树种子成熟脱水的活力保护过程起一定作用,为了解茶树抗逆分子机制提供了一定的理论基础.     

油菜叶片衰老相关基因的分离：细胞色素P450cDNA的克隆和序列 …

通过绿叶和衰老叶片ｃＤＮＡ的缩减杂交和差别筛选，富集并分离了缩减ｃＤＮＡ文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段。以目的基因片段为探针，通过筛选油菜衰老叶片的ｃＤＮＡ文库，分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长ｃＤＮＡＬＳＣ４６。     

蓖麻细胞色素P450基因片段的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法克隆了蓖麻细胞色素P450基因的正反2个片段。正向片段长为525个碱基,反向片段长为421个碱基。经测序分析,得到的正向基因片段和反向基因片段与GenBank上的蓖麻细胞色素P450基因（XM₀02525863.1）的碱基同源性分别为98.85%和99.51%。利用载体pHANNIBAL和限制性内切酶将正反2个片段连接成具有发夹结构的中间载体pHAN-P450S-P450A,然后将中间载体和表达载体pBI-121连接,构建了P450基因的RNAi植物表达载体,为利用RNA干扰抑制P450基因表达的研究奠定了基础。     

苦荞细胞色素CYP81家族同源基因FtP450-R4的克隆、分子鉴定及其功能分析

细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450)是高等植物中最大的酶蛋白家族之一,广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理.本研究采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNAends,RACE)技术,获得苦荞(Fagopyrum tataricum) CYP81家族同源基因FtP450-R4 (GenBank登录号:KM271986).FtP450-R4 cDNA全长1770bp,5'-UTR为49 bp,3'-UTR为194bp,ORF为l 527 bp,其ORF序列可编码508个氨基酸残基的蛋白.生物信息学分析表明,FtP450-R4蛋白通过N-端4～24位氨基酸残基定位于内质网,与F3'H (flavonoid 3'-hydroxylase)、I2'H (isoflavone 2'-hydroxylase)和其他CYP450的同源性在44％～46％之间;多重序列比对显示,FtP450-R4具有CYP450中经典的基序和保守序列,但不含F3'H的特征基序(GGEK);系统进化树分析显示,FtP450-R4与拟南芥(Arabidopsis thaliana) CYP81家族和I2'H聚为一大簇,说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答.UV-B、寒冷和干旱均能引起FtP450-R4在苦养子叶中表达量的显著变化,而在胚轴中其表达量变化不显著.利用大肠杆菌(Escherchia coli) BL21 (DE3)菌株对FtP450-R4蛋白进行了可溶性表达,活性鉴定表明,重组FtP450-R4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和山奈酚为底物进行酶促反应,具有生物学活性.本研究可为了解CYP450在黄酮合成代谢中的功能,明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料.     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶基因(ScAPX)的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要酶类.本研究对针刺接种黑粉菌(Sporisorium scitamineum)后的抗、感基因型甘蔗(Saccharum officinarum)进行APX活性测定.结果表明,甘蔗接种黑穗病菌48h内,抗病品种(崖城05-179) APX活性显著高于感病品种(柳城03-182) (P＜0.05).借助电子克隆技术,结合RT-PCR方法,从甘蔗中分离到一个APX基因,并命名为ScAPX(GenBank登录号:KJ7565501).生物信息学分析显示,ScAPX基因全长l 171bp,包含一个1 038 bp的完整开放阅读框,编码345个氨基酸.ScAPX编码的蛋白不含信号肽,推测其为非分泌蛋白,定位于线粒体基质和叶绿体基质中的概率分别为91.1％和88.7％.实时荧光定量PCR检测结果显示,ScAPX在甘蔗根、芽、叶、蔗皮和蔗髓中均有表达,为组成型表达基因,表达量在蔗皮中最高,叶中最低,前者是后者的19.7倍;在外源因子处理后0～48 h,ScAPX基因的表达受水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、氯化钠(sodium chloride,NaCl)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)诱导,SA、MeJA和H2O2处理后的ScAPX 转录本积累量峰值较外源激素(ABA)和环境(NaCl和PEG)胁迫早.前者的ScAPX转录本变化呈现出胁迫初期积累量增加,达到峰值后又逐步下降的特点;在同样的测试时间(处理后24 h)内,ABA、NaCl和PEG处理后ScAPX转录本在达到峰值后未见下降.虽然在外源胁迫下,ScAPX表达量变化存在明显差异,但其表达均表现出正响应上述外源因子对甘蔗的胁迫.本研究为后续深入鉴定该基因的功能与进一步应用提供基础资料.     

4种鱼类肝脏细胞色素P450对毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷的脱硫代谢

以毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷为供试农药,以斑马鱼、剑尾鱼、麦穗鱼及太阳鱼为供试生物,研究了3种农药对4种鱼的急性毒性,4种鱼肝细胞色素P450对3种农药的脱硫代谢作用及两者之间的相关性。结果表明,毒死蜱对于上述4种鱼的96hLC50分别为1.94、0.171、0.0273、0.0681mg·L^-1;对硫磷为2.6、0.0559、1.78、1.02mg·L^-1;马拉硫磷为7.07、0.907、6.03、0.172mg·L^-1。4种鱼肝脏P450对于毒死蜱代谢的Vmax/Km值分别为1.67×10^4、2×10^4、5×10^4、2×104min^-1;对于对硫磷代谢的Vmax/Km值分别为2×10^4、5×10^5、1.11×10^5、1.43×10^5min^-1;对于马拉硫磷的值分别为5×10^3、5×10^4、2.5×10^3、1.67×10^4min^-1。96hLC50值与Vmax/Km值大体呈负相关,其中毒死蜱的相关性较弱,对硫磷及马拉硫磷的相关性较强（R^2值分别为0.2181、0.8490、0.5102）。研究结果说明P450在鱼类耐药性形成过程中发挥了阻碍作用。     

小鼠卵巢内细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶的发生

利用免疫组织化学技术探讨了细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶[P450（SCC）]在小鼠卵巢内的发生时相，研究发现15日龄的胎鼠卵巢内即存在P450（SCC）的免疫染色；出生前后卵巢内的基质细胞和前体颗粒细胞中均可检测到P450（SCC）的免疫染色，伴随卵泡发育，产后10d的小鼠卵巢次级卵泡膜细胞开始出现P450（SCC0的免疫染色，并随着日龄的增加而逐渐增强；临近性成熟小鼠卵巢内较大的有腔卵泡颗粒细胞也开始出现P450（SCC）的免疫染色。研究结果初步阐明了P450（SCC）在卵巢内的发生时相和表达模式；产后小鼠卵巢内P450（SCC）伴随次级卵泡膜细胞的形成而发生；优势卵泡排卵前的成熟发育进程中壁层颗粒细胞逐渐获得表达P450（SCC），进而分泌孕酮的能力。     

红花花青素还原酶基因ANR的克隆及表达分析

花青素还原酶(ANR)是类黄酮代谢途径下游合成原花青素的关键酶,对花青素含量有一定的负调控作用。为探索ANR基因在红花(Carthamus tinctorius L.)中的序列特征及其与红花花色的关系,采用反转录PCR方法从红花中克隆ANR基因,对其进行生物信息学和系统进化分析,并检测了其在不同花色红花品种的不同组织部位及不同花期的表达量。结果表明,CtANR最长开放阅读框(ORF)为1 020 bp, 编码339个氨基酸,分子量为37 958.28,理论等电点为5.87,为不稳定的亲水性蛋白,属于NADB-Rossmann超家族,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。CtANR和刺菜蓟ANR的同源性最高,为83.98%,与刺菜蓟ANR的亲缘关系最近,与梅花、欧洲甜樱桃ANR的亲缘关系较远,模体基序相差较大。定量分析表明,红色和白色红花品种中,CtANR基因都是在果球形成初期表达量最低,其次是根和茎中表达量较低,而在花中的表达量相对较高。在花发育的不同时期,红色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高-降低的趋势,而白色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高的趋势。在不同花色的红花品种中,CtANR基因的表达量在花发育的S1、S3和S5时期差异极显著(P<0.01),S4、苞片、根、叶中差异显著(P<0.05),其他时期与其他组织中差异不显著。本研究为解析红花类黄酮生物合成的分子机制及红花花色相关基因的研究提供了理论基础。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

半滑舌鳎trim36基因cDNA克隆及表达分析

三重基序蛋白(the tripartite motif-containing protein,TRIM)家族是一类结构保守、进化快速的E3泛素蛋白连接酶,参与诸多重要的生命过程.TRIM36是TRIM家族的一员,trim36编码E3泛素蛋白连接酶.本研究在已完成的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组测序及转录组测序的基础上,利用RACE技术克隆得到半滑舌鳎trim36基因(GenBank登录号:KU244470),序列全长为2 899 bp,其中ORF为2 214 bp,编码737个氨基酸,5’非翻译区(untranslated regions,UTR)为289 bp,3'UTR为396 bp.生物信息学分析显示,半滑舌鳎TRIM36蛋白包含1个锌指结构,2个B-BOX类型锌指蛋白结构域(B-Box-typezinc finger,BBOX),1个卷曲螺旋结构,1个羧基末端的纤连蛋白Ⅲ(fibronectin typeⅢ,FN3)结构域和1个双特异性蛋白激酶spla和兰尼碱受体(spla kinase and ryanodine receptor,SPRY)结构域.此外,在不同脊椎动物中,trim36基因与其邻近的基因具有保守的共线性关系.半定量RT-PCR及qRT-PCR结果显示,在半滑舌鳎不同组织中,trim36基因表达存在差异.trim36在卵巢中表达量最高,其次为雌、雄鱼的脑中;不同发育时期中,trim36基因在120日龄半滑舌鳎性腺中开始表达,且卵巢表达量显著高于精巢(P＜0.05).原位杂交结果显示,trim36基因杂交信号主要出现在Ⅰ期和Ⅱ期卵母细胞.trim36时空表达特征表明,其在卵巢腔的形成及Ⅰ期、Ⅱ期卵母细胞的形成中起重要作用.结果表明,trim36在性别发生方面有一定的作用,这为进一步研究鱼类ttim36基因功能及TRIM家族基因功能提供线索和参考.     

香菇低温胁迫应答基因的克隆及其表达分析

用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术相结合，从香菇(Lentinula edodes)苏香菌株中得到了1个与低温胁迫相关的全长2 432 bp的cDNA，该基因含1个1 962 bp的开放式阅读框，基因组序列分析发现该基因有11个内含子。经数据库同源查找及序列比较，发现该基因编码的氨基酸与青霉菌(Penicillium nordicum)的聚酮合酶和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-氨基己二酸还原酶分别具有30%、22％的同源性和46%、40%的相似性。表达谱分析表明，当低温胁迫的温差为5 ℃时，该基因即开始表达，但mRNA丰度较低；温差达到10 ℃时，mRNA达到最大表达量；低温胁迫处理后，该基因在菌丝转色前的表达丰度低于转色后的丰度。将该基因初步命名为ICS (gene induced under cold stress, GenBank登录号为DQ211659)，并初步推测该基因可能参与了低温胁迫的信号传导，低温胁迫信号在影响氮代谢后进而诱发子实体的形成。     

橘色双冠丽鱼TYR基因的克隆及其发育时序和组织表达分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是动物体内黑色素合成信号通路中起关键性作用的限速酶,黑色素生成的速度和种类取决于TYR基因的表达量和活性水平.为了解色素相关基因与体色变化的关系,采用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) TYR基因cDNA全序列,并利用qRT-PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中TYR基因的表达差异.实验获得cDNA全长序列2 683 bp,其中阅读框1 620bp,编码540个氨基酸,5'UTR区246 bp,3'UTR区817 bp.氨基酸序列和系统发育分析表明,相比与脊椎动物间的保守性,TYR蛋白序列在鱼类间的保守性更高.qRT-PCR结果表明,TYR基因在胚胎各期均有表达,受精期表达量最低,血液循环期开始急速上升;在“黑色-灰色-亮黄色”三个典型体色褪黑过程中,各组织TYR基因表达量均在黑色期呈现最高值,显著高于灰色和亮黄色期,灰色到亮黄色时期鳞片和尾鳍的TYR基因表达量逐渐降低,但差异不显著(P＞0.05),而皮肤组织的TYR基因表达量在三个体色褪黑期均显著降低(P＜0.05);亮黄色时期,TYR基因在心、肾、脑、鳔、性腺、尾鳍和眼等组织均有表达,其中眼部表达量最高,其次是鳔和尾鳍,皮肤和性腺表达量最低.橘色双冠丽鱼TYR基因在三个典型体色褪黑期表达逐渐降低,可能与红色素细胞和黄色素细胞逐渐增多以及黑色素细胞数量和分布比例发生变化相关.本研究通过了解体色变异的分子基础,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料.     

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基基因(COⅡ)序列的不同地理种群桃蛀螟的系统发育研究

桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)是一种食性杂,为害十分严重的害虫,近年来发现其对玉米的为害呈加重趋势.为了揭示桃蛀螟不同地理种群内及种群间的遗传分化和系统发育关系,本研究对来自我国广西、广东、四川、浙江、山东、河北、河南、北京和辽宁等省(市、区)的24个地理种群622头桃蛀螟个体的线粒体细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基基因(COⅡ)片段(648 bp)进行了序列分析,共有51个变异位点,变异位点占分析总位点数的7.87％,形成了53种不同的单倍型(GenBank登录号为JQ363873～JQ363922).在桃蛀螟COⅡ基因片段的核苷酸序列中,A+T平均含量为75.32％,表现明显的A/T偏倚性.24个地理种群的平均基因流(Nm)为1.09,总群体的固定系数(Fst)为0.18629,表明我国桃蛀螟总群体产生了一定程度的遗传分化.北方和东部(Fst=0.01197)和西南地区(Fst=0.0133)遗传分化系数较小,而南方地区(Fst=0.24381)种群内部的遗传分化系数较大,基因流也呈现相对应的结果(北方和东部地区Nm=41.58,西南地区Nm=118.90,南方地区Nm=0.99),表明南方地区桃蛀螟的遗传分化程度明显大于北方和东部以及西南地区.对53种单倍型用邻接法构建系统发育树和单倍型网络结构关系图,结果发现,南方地区广东和广西的桃蛀螟和其他地区不同寄主上的桃蛀螟之间存在比较明显的遗传分化,而其他地区桃蛀螟单倍型与地理种群之间没有明显的对应关系;AMOVA分子方差分析结果表明,中国桃蛀螟的遗传分化主要来自种群内部(89.99％);对其群体进行核苷酸错配分布分析,并对地理种群的历史发生动态进行Tajima's D和Fu's Fs test中性检测,结果发现,群体核苷酸错配分布呈现一个不平滑的单蜂,并且桃蛀螟种群Taijima's D为负值(-2.5776),且达到显著水平,Fu's Fs值是绝对值很大的负值(-112.603),结果证明,桃蛀螟种群在演化历史中发生过种群扩张,并且扩张时间久远,发生在至今大约46700～116800年以前.