猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP3-GP5-M融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业发展的传染病,为了PRRSV GP3-GP5(N-糖基化蛋白)-M(膜蛋白)融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性,本研究利用脂质体法将构建好的真核重组表达质粒pcDNA3.1-ORF3-ORF5-ORF6转染猪肾细胞(PK-15细胞),经G418(600 μg/mL)筛选(72 h)获得稳定表达PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白的稳定细胞株.以RT-PCR分析目的基因转录;间接免疫荧光检测融合蛋白表达;Western blot和小鼠(Mus musculus)免疫试验检测融合蛋白免疫原性.结果表明,RT-PCR检测到3种目的基因的转录;间接免疫荧光检测到融合蛋白得以表达,Western blot检测到融合蛋白可与阳性猪血清发生特异性反应.小鼠免疫试验二免后S/P=样本/阳性对照的比率,达到1.80(S/P＞0.4为阳性),并且至少可以持续1个月.本研究成功实现了PRRSV GP3-GP5-M 融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达,证实PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白具有良好的免疫原性,为PRRSV 多基因核酸疫苗研制提供了基础资料.     

慢病毒介导shRNA干扰颗粒体蛋白前体(GRN)促进猪前体脂肪细胞分化

为研究颗粒体蛋白前体(granulin,GRN)在脂肪细胞发育过程中的作用,本实验构建了GRN短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA的表达变化情况。结果显示,GRN慢病毒干扰载体病毒滴度在5×107TU/mL以上,病毒感染前体脂肪细胞后显著降低了GRN的表达,shRNA2干扰效率最高,达到76%,沉默GRN后能够促进猪前体脂肪细胞分化;脂肪细胞分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节原件结合蛋白(SREBP-1c)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(ap2)和脂蛋白酯酶(LPL)基因mRNA表达量均升高。结果表明,降低GRN基因表达促进了猪前体脂肪细胞分化,揭示GRN在猪前体脂肪细胞分化过程中可能起到抑制作用。     

小麦TaFKBP62c-2B基因克隆、组织表达及亚细胞定位

FK506结合蛋白(FK506 binding protein,FKBP)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-proly cistrans isomerase,PPIase)活性,可以作为一种分子伴侣在蛋白折叠中发挥作用.本研究采用同源基因克隆获得小麦(Triticum aestivum)高温胁迫应答基因TaFKBP62c-2B,利用qRT-PCR和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)示踪技术明确了TaFKBP62c-2B的表达模式和亚细胞定位信息.序列分析结果表明,小麦TaFKBP62c-2B基因含有37 bp的5'UTR区、1 926 bp的完整CDS以及176 bp的3'UTR区,共编码642个氨基酸(GenBank登录号:KU350629).结构域分析发现,TaFKBP62c-2B是由3个FK506结合保守域(FKBP_C)和3个三十四肽重复序列(tetratricopeptide repeat,TPR)构成的多域FKBP.qRT-PCR结果显不,TaFKBP62c-2B强烈响应高温胁迫;组织表达分析表明,TaFKBP62c-2B主要在小麦的茎和小穗等植株地上组织中表达,在根部的表达量较低.亚细胞定位表明,TaFKBP62c-2B位于内质网上.本研究获得了小麦TaFKBP62c-2B基因全长、明确了其表达规律以及亚细胞定位信息,为进一步了解TaFKBP62c-2B的生物学功能提供了基础资料.     

猪圆环病毒2d亚型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达

为了在昆虫细胞中表达猪圆环毒病2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白,本研究设计合成引物从临床病料中扩增获得猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)山东株衣壳蛋白基因缺失核定位区的序列,并进行序列分析.将该片段克隆到杆状病毒供体载体pFastBac-1上,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10-Bac感受态细胞,获得重组穿梭杆粒,将该杆粒转染到sf9昆虫细胞中,观察重组杆状病毒致细胞病变效应,并采用PCR、间接免疫荧光实验、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定衣壳蛋白的表达情况.结果表明,扩增获得的猪圆环病毒山东株属于PCV2d亚型,与我国目前使用的商品化疫苗株(PCV2a及PCV2b亚型)在160～180 aa抗原位点有差异.成功构建了重组供体质粒pFastBac l-PCV2d-Cap和重组穿梭杆粒Bacmid-PCV2d-Cap,获得的重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了约24 kD的PCV2d-Cap,该蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清及His标签抗体发生反应,证明具有良好的反应原性.本研究是我国首次采用杆状病毒系统表达PCV2d亚型衣壳蛋白,为制备PCV2d亚单位疫苗以及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、防范PCV2d亚型流行提供了理论依据.     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因在Hela细胞中的表达及表达蛋白的定位

猪圆环病毒（Porcine circovims，PCV）属于环状病毒属，该病毒无囊膜，基因组为单链环状DNA，大小约为1．7kb，编码2个主要的开放阅读框架：ORF1和ORF2，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Nawagitgul et al，2000），可能在PCV2病毒致病方面具有重要的作用。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）．给养猪业带来了巨大的经济损失。分别用ORF2基因的亚单位疫苗免疫猪、核酸疫苗免疫小白鼠，均具有良好的效果（Blanchard et al，2003；Kamstrup et al，2004）。关于PCV2疫苗的研究在我国尚未处报道。本实验在异源启动子CMV下实现了ORF2在真核细胞中的表达。     

花生AhMKK4基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

为挖掘花生抗逆相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,根据cDNA文库中已知的促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因EST序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMKK4基因。结果表明,AhMKK4基因序列全长1 434 bp,含有3'非编码区151 bp,5'非编码区317 bp,开放阅读框全长966 bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74 kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。RT-qPCR分析发现,AhMKK4基因在根中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMKK4基因受JA和IAA诱导时表达量上调,受SA和ABA诱导时表达量下调,说明该基因可能参与到JA和IAA介导的信号转导途径;AhMKK4在盐胁迫下表达量上调,说明该基因可能参与花生对盐胁迫的适应性调控。本研究结果为花生抗逆育种研究提供了新的基因资源。     

海洋双RNA病毒(MABV)vp2e和vp3基因在昆虫细胞中的高效表达

海洋双RNA病毒(Marinebirnavirus,MABV)可引起多种海洋鱼贝的腹水病等病症。利用RT-PCR技术得到了MABVY-6株系A片段的cDNA,进而克隆了病毒的外壳蛋白VP2e的抗原决定簇区642bp片段(vp2e)和另一结构蛋白VP3编码区序列。通过转座作用构建了重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中对VP2e和VP3进行了表达。SDS-PAGE检测和薄层扫描表明,VP2e和VP3与增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)融合蛋白表达量分别占整个昆虫细胞蛋白的15.8%和8.2%。用HisTag单抗和MABV病毒多抗对表达的VP2e融合蛋白进行Westernblot检测,结果表明表达产物具有很好的抗原性。同样,用HisTag单抗和VP3多抗对表达的VP3融合蛋白进行的Westernblot检测,证明融合蛋白表达正确,并且表达产物可溶,易于纯化。实验结果为该病毒结构蛋白和MABV疫苗研究提供了基础。     

棉铃虫核型多角体病毒ORF27基因的表达和细胞内定位

棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）ORF27编码区全长768bp，编码255个氨基酸残基组成的多肽，预计分子量29.5kD。PCR扩增获得该基因，克隆到融合表达载体pGEX-4t-2中，表达蛋白分子量55.5kD，表达量约占细菌总蛋白的9.2%。割胶透析法纯化融合蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体。再把该基因插入到转移载体pFastBacHTb，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，构建重组病毒；提取病毒基因组DNA，在Lipofectin介导下转染昆虫细胞Tn-5B1-4。表达蛋白分子量为32kD，表达量约占细胞总蛋白的2.9%。将ORF27在昆虫细胞中表达产物固定，免疫电镜法确定表达蛋白主要存在于细胞的细胞质中。ORF27基因表达及在细胞内定位为其进一步研究提供了基础。     

干扰水稻瘤矮病毒(RGDV)非结构蛋白(Pns12)的表达抑制病毒在介体昆虫培养细胞内的复制

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus),由介体电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传播,其基因组第12条片段编码的非结构蛋白(nonstructural protein,Pns12)是提供病毒复制和子代病毒粒体装配场所——病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确Pns12在RGDV侵染介体电光叶蝉培养细胞中的功能,本研究通过原核表达的Pns12蛋白免疫注射兔(Oryctolagus cuniculus),制备Pns12抗体,并应用免疫荧光标记和RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术研究Pns12在介体培养细胞内的定位和参与病毒原质形成的过程。共聚焦显微镜观察到,病毒侵染的细胞中,与荧光素交联的Pns12抗体特异地标记在病毒原质上。干扰Pns12蛋白表达后,可有效地阻碍病毒原质的形成、子代病毒粒体的组装和病毒非结构蛋白Pns12和外壳蛋白P8蛋白的表达,表明Pns12作为病毒原质的组分参与了RGDV在介体培养细胞内的复制。也表明,Pns12可作为理想的靶标用于阻断电光叶蝉携带和传播RGDV。     

猪resistin(Retn)基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。     

家蚕质多角体病毒RDRP基因的克隆、表达及定位

应用分段RT-PCR的方法从家蚕质多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedmsis virus,BmCPV）中国株的dsRNA中成功地克隆了RDRP基因(RNA-dependent RNA polymerase),基因序列全长3691bD,并登录GenBank,序列号为AY496445。利用质粒载体pET-28b成功地构建了表达质粒pET28b-RDRP,并用IPTG诱导的方法在大肠杆菌(Escherichia coil)BL21（DE3)中获得表达,分子量约为138kD。以重组蛋白的兔抗为一抗,15mm山羊抗兔IgG-胶体金为二抗,进行免疫标记,电镜定位,结果显示在病蚕中肠的柱状细胞的游离病毒粒子和多角体内的病毒粒子上均能结合胶体金颗粒,标记率为35％左右,证明BmCPV病毒的RDRP复合物确实位于病毒衣壳上。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠免疫试验

将纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒利用杆状病毒表达系统进行表达,表达产物应用SDS-PAGE、Western blot和Dot ELISA进行分析,确定所表达的蛋白分子量大小约为67kD,且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察,可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的灭活疫苗免疫组及磷酸盐缓冲液(PBS)接种组作为参比对照,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明,表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒,不仅能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,还能刺激小鼠产生高效价的抗猪细小病毒的特异性抗体,而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

PR结构域蛋白1(PRDM1)慢病毒表达载体的构建及其对脐带间充质干细胞(hUC-MSC)向生殖细胞诱导分化的影响

PR结构域蛋白1基因(PR domain containing 1,with ZNF domain,PRDM1)作为原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)形成过程中的一个重要起始因子,在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向PGC的发育分化过程中发挥重要作用。为了研究其在成体干细胞诱导分化中的作用,本研究PCR克隆获得小鼠(Mus musculus)PRDM1基因(GenBank登录号:JX154081.1),构建了PRDM1慢病毒表达载体pCDH-PRDM1,通过293T细胞包装病毒,用携带有PRDM1基因的病毒颗粒转导脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)。结果表明,PRDM1基因成功在hUC-MSC中超表达;PRDM1基因能引起生殖相关基因胚胎特定时期抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)、多能性相关蛋白3(developmental pluripotency associated 3 Dppa3,STELLA)、干细胞生长因子受体(stem cell growth factor receptor,C-KIT)和性别决定基因-同源盒2(sex determining region Y-box 2,SOX2)的上调,为进一步研究该基因的功能和提高干细胞向生殖细胞诱导分化研究奠定了一定的基础,并且为hUCMSC向生殖细胞的诱导分化提供了一个新的思路。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)福建分离株核衣壳蛋白基因(N)的克隆与表达分析

猪传染性胃肠炎(swine transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,是我国法定检疫的疫病。为研究福建省猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)核衣壳蛋白基因(N)的分子特征及其原核表达产物的抗原性,参照GenBank中的TGEV全基因序列,设计合成一对扩增TGEV福建(FJ)分离株N基因的特异性引物,进行克隆和序列分析,结果表明,TGEV-FJ株N基因全长1149bp,编码382个氨基酸(GenBank登录号JQ700302),与国内外23株TGEVN基因的核苷酸同源性,氨基酸同源性进行比较分析,N基因核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。TGEV-FJ株N基因克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白约为68kD,与预期分子量一致;Western blot分析表明,重组蛋白能与抗TGEV阳性血清反应出现特异性条带;以纯化的重组TGEVN蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性,送检20份猪(Sus scrofa)TGEV阳性血清样本中检出16份阳性结果、10份阴性血清样本中检出9份阴性结果。利用纯化的TGEV重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了1株特异性好并能稳定分泌抗TGEVN蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1-27),间接免疫荧光试验证明,该单抗能特异性识别TGEV全病毒抗原。TGEVN蛋白的单克隆抗体制备为建立TGEV免疫学检测方法提供了基础资料。     

牛支原体pdhα和pdhβ基因的克隆、原核表达及亚细胞的定位

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病.丙酮酸脱氢酶复合体E1 (pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化.本研究参照GenBank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα (GenBank登录号:KU355295)及pdhβ基因(GernBank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR (Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒pET-pdhα和pET-pdhβ.表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropy1β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E 1α亚基融合蛋白PDHA及PDHcE1β亚基蛋白PDHB.纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHcE1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究.结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白rPDHA及rPDHB的分子量分别约为40和37kD,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当.本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料.     

鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.     

黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。     

牛巨噬细胞天然抗性蛋白Ⅰ基因可变剪接体(NRAMPI-ISO)的克隆及在细胞和组织中的表达

巨噬细胞天然抗性蛋白1 (NRAMP1)可抑制结核分枝杆菌(Mycobacterium)和布氏杆菌(Brucella)等多种胞内寄生病原菌的感染,提高动物机体的抗病能力.本研究从秦川牛脾脏中克隆了NRA MP1基因的一种可变剪接体NRA MPI-ISO,序列分析表明,NRA MPI-ISO比NRAMP1多了第3个内含子,从而导致编码序列提前终止于第3个内含子,NRA MPI-ISO编码200个氨基酸.为了探索可变剪接体NRAMPI-ISO的表达情况,本研究分别构建了原核表达载体pET-41-NRA MPI-ISO和真核表达载体pEGFP-NRA MPI-ISO.原核表达载体pET-41 -NRA MPI-ISO可在不同浓度的IPTG诱导下在大肠杆菌BL21中高效表达.真核表达载体pEGFP-NRA MPI-ISO转染牛成纤维细胞后,EGFP-NRAMP 1-ISO融合蛋白分布在细胞核和细胞质中,而正常的NRAMP1蛋白只分布在细胞质的溶酶体膜周围.半定量RT-PCR检测表明,NRA MPI-ISO基因在心、脾脏、肺脏等组织有较高的表达,而在脑、胰、生殖嵴中的表达量相对较低.本研究为进一步研究NRA MPI-ISO基因生物学功能提供了重要信息.     

39K基因对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和转录的影响

39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白.迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV) 39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚.本研究利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和回补39K基因,构建了39K缺失型病毒39K-ko-Bacmid和修复型病毒39K-re-Bacmid,并分别转染家蚕(Bombyx mori)细胞系BmN细胞,发现二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度.进一步利用qPCR发现,39K基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(P＜0.01).为了进一步了解39K基因对BmNPV极晚期基因多角体启动子的表达调控作用,本研究构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶报告系统,通过定量检测荧光素酶活性的变化情况,证明了39K基因对多角体启动子具有显著的负调控作用.综上所述,可知39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的表达水平,并导致多角体基因启动子的启动活性增强.本研究结果将为深入了解BmNPV 39K基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒(Bombyx mori baculovirus)表达系统高效转录机制的研究提供资料.     

中华鼢鼠卵透明带3基因(mZP3)真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达

卵透明带3(zona pellucida 3,ZP3)蛋白是精卵结合最重要的受体。为了构建中华鼢鼠(Myospalax fontanierii)卵透明带3(mZP3)基因真核表达载体,本研究利用PCR方法得到加入酶切位点的mZP3片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,体外转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和尾静脉注射昆明小鼠(Mus musculus)体内,利用RT-PCR和Western bolt技术检测其表达情况。双酶切和基因测序鉴定结果表明,所构建的表达载体是pEGFP-mZP3;倒置显微镜观察到发绿色荧光的成功转染的细胞;RT-PCR和Western bolt检测结果表明,目的基因mZP3在CHO细胞中成功表达,并且小鼠肝脏内也检测到目的基因。研究结果表明,卵透明带3基因能够在CHO真核细胞内表达,为后期基因疫苗防治中华鼢鼠提供依据。