基于M蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立

犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-M基因,构建原核重组表达载体p ET-28(a)-CDV-M,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-M作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-M蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDVM得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/m L。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88μg/m L,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于M蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及M蛋白的功能研究提供了工具。     

杆状病毒AcMNPV orf59基因的克隆表达、抗体制备及亚细胞定位

用PCR方法从苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）基因组中扩增到orf59基因,插入原核表达载体pET-32a(+),构建pET-Ac59质粒,再将该质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为30kDa的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞（Sf9）中orf59基因的表达,结果显示：在感染后的细胞中有两条分子量分别约为38kDa和25kDa蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现：在病毒感染的晚期,Ac59蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。这些研究为下一步深入进行Ac59功能的研究奠定了一定的基础。     

甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的核苷酸序列合成引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得ＣＰ基因后,再将其克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,经ＩＰＴＧ诱导,ＣＰ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得了高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了ＳＰＦＭＶ外壳蛋白的特异性抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和点免疫（Ｄｏｔｂｏ     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。     

杆状病毒SpltMNPV gp41基因的克隆、表达及抗体制备

摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virus，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（Budded virus，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedro virus，SpltMNPV）gp41基因, 并将其克隆至5′端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌(Escherichia coli )M15[pREP4]，在1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9 kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPV GP41蛋白。     

家蚕真核细胞翻译起始因子(BmeIF4E)基因的克隆、表达及功能分析

本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子钮基因(BmeIF4E)具有较高的相似性,推测可能是家蚕eIF4E基因,将该序列命名为BmeIF4E,GenBank登录号为DN443192.为研究BmeIF4E的生物学功能,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白,制备多克隆抗体.利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明,BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中.荧光定量PCR和Westem blot分析结果表明,在不同组织及发育时期该基因的表达有差异,在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量较低.以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA,脂质体法转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况,发现BmeIF4E基因被干扰后,总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组.MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降.研究结果提示,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均有表达,起着十分重要的作用.     

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。     

利用菊花B病毒外壳蛋白特异片段进行多克隆抗体的制备与分析

菊花B病毒(CVB)是乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员,在浙江杭白菊基地普遍存在。为了能够特异、快速、简便检测CVB,利用SWISS-MODEL分析CVB外壳蛋白(CP)的三维结构,选择暴露在CVB CP三维空间结构外部的片段,片段之间使用连接肽串联以提高柔性,重复4个片段,根据大肠杆菌密码子的偏爱性将其相应的DNA序列进行优化,将合成的特异DNA序列连接表达载体pET-28a(+),转化至Escherichia coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了纯化后大小约为14 kDa的融合蛋白;将其作为抗原免疫家兔制备抗血清,纯化获得相应抗体;对获得的抗血清和抗体进行酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白免疫印迹(WB)检测。间接ELISA检测结果表明,512 000倍稀释的抗血清可检测到1 μg抗原。纯化后最终得到浓度为15 mg·mL^-1 的抗体,WB检测结果,1∶1 000稀释后的抗体可检测500 pg抗原,且能够特异性结合CVB CP蛋白。本研究制备的多克隆抗体为检测CVB提供了便利,也为后续CVB检测试纸条的开发提供了技术支撑。     

禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70％;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一.本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) (A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01 (H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析.首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得cDNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切将其定向插入pGEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达.该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出.为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析.结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90％以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S 1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好.研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料.     

苦荞黄酮醇合酶FtFLS2的重组表达及多克隆抗体制备

黄酮醇合酶催化二氢黄酮醇生成黄酮醇,是黄酮类物质代谢途径中的关键酶。为深入研究苦荞黄酮醇合酶在苦荞黄酮类物质代谢中的功能,本研究采用同源克隆技术获得苦荞黄酮醇合酶基因Ft FLS2,并构建原核表达载体p ET47b-Ft FLS2;对经钴离子螯合层析柱纯化的重组蛋白进行活性分析并制备多克隆抗体。结果表明,Ft FLS2在大肠杆菌BL21 Star(DE3)中以可溶性形式高效表达,重组蛋白具有将二氢槲皮素转化为槲皮素的催化活性;Western blotting结果显示,Ft FLS2主要在苦荞未成熟种子中表达。多克隆抗体的制备为从蛋白表达水平上分析Ft FLS2与苦养黄酮类化合物累积的关系奠定了基础。     

烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用

为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中,通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白.用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清.DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacumL.)样品及传播介体的检测.本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件.     

水稻PDK2基因原核表达和多克隆抗体制备

本研究以水稻幼苗为材料,通过RT-PCR扩增得到1.1kb的编码PDK2(登录号:AK100033)基因的片段,成功构建重组表达载体pET-23d-PDK2并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。研究结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在,且PDK2的最佳表达条件为:28℃,120r/min,0.5mmol/L IPTG诱导60min。经纯化后免疫新西兰大白兔以制备PDK2多克隆抗体。Western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好,这为进一步研究水稻PDK2的生物学功能奠定了基础。     

拟南芥质膜水通道蛋白RD28保守区段在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备

实验利用ＰＣＲ技术,从拟南芥原膜水旧白ＲＤ２８的ｃＤＮＡ中扩增了所有植物细胞质膜水通道蛋白保守区段（４２０ｂｐ）,并将其构入ｐＧＥＸ－ＫＧ。酶切、测序分析表明重组质粒ｐＧＥＸ－ＲＤ２８结构正确。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ可诱导表达分子量约４０ｋＤ融合蛋白ＧＳＴ－ＲＤ２８,该蛋白主要以非包涵体的形式存在。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱纯化得到了高纯度Ｇ     

烟草WRKY12基因的分离、表达与多克隆抗体的制备

在高等植物中,WRKY转录因子家族成员广泛参与植物的生长发育、代谢、生物胁迫和非生物胁迫等生理过程的调控.本研究采用同源序列克隆的方法获得烟草WRKY12基因,序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第2类成员,只有一个WRKY结构域,锌指结构为C-X4-C-X23-H-X1-H.构建系统发育树结果表明,它与大豆中GmWR...     

抗对硫磷基因工程抗体ScFv的制备及其初步鉴定

用一段45个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗体重链和轻链可变区基因片段VH和VL,获得了抗对硫磷单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,构建了抗对硫磷scFv基因原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot分析显示,该单链抗体基因能在大肠杆菌Origami 2中特异性表达,融合蛋白分子量约为28kD。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,得到目的蛋白纯度为74.8%;ELISA反应结果证明,该单链抗体可以与对硫磷发生特异性反应。     

家蚕肌钙蛋白CⅢ基因的原核表达及其抗体的制备

家蚕肌钙蛋白CⅢ(TnCⅢ)是肌钙蛋白C(TnC)的一种亚型结构,本研究利用大肠杆菌表达TnCⅢ融合蛋白,并制备其多克隆抗体.从本实验室的家蚕(Bombyx mori)蛹cDNA文库中搜索到1条编码家蚕肌钙蛋白CⅢ亚型的cDNA序列,将其命名为BmTnCⅢ(Bombyx mori TnCⅢ).该cDNA序列含有完整的ORF,可编码153个氨基酸残基组成的TnCⅢ蛋白.根据该cDNA序列,设计带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,通过RT-PCR的方法从家蚕蛹总RNA中扩增到BmTnCⅢ亚型基因的完整的ORF序列(GenBank登录号为DQ889211),并将其重组到原核表达载体pET-28a相应的酶切位点上.将获得的重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白后,在分子量约21 kD处出现融合蛋白条带.用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-Tag BmTnCⅢ,并以此为抗原免疫雄性新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus),制各了该融合蛋白的多克隆抗体.Western blot结果表明,该多克隆抗体具有较高的特异性,可用于后续的组织分布与定位研究.     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.     

牛病毒性腹泻病毒E2结构蛋白的原核表达、纯化及鉴定

根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2基因设计1对特异性引物,以Oregon CV24株为模板,PCR扩增目的片断后与pET-32a原核表达载体连接,转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果表明重组E2蛋白在体外得到较好表达,表达的融合蛋白分子量为57.7 ku。可溶性分析表明重组E2蛋白以包涵体的形式存在,经镍柱His标签蛋白纯化后进行western-blot检测。结果表明：E2重组蛋白均具有反应原性,能与BVDV的阳性血清进行反应。     

H5亚型禽流感病毒HA基因的克隆、表达及其生物学活性的初步分析

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒（Avianinfluenza virus,AIV）血凝素（HA）基因序列设计引物,经RT-PCR扩增HA基因的HA1片段,再将其克隆到原核表达载体PET-28a中,用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）原核表达,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定.Western blot结果表明,表达蛋白能与H5亚型AIV单特异性血清特异性反应.交叉反应试验表明,此蛋白具有良好的抗原性,可被H5亚型AIV抗体特异性识别且无交叉反应.用变性纯化后的蛋白建立了对AIV抗体检测的间接ELISA,并对236份鸡血清样本进行了实验室检测.检测结果与血凝抑制试验检测结果符合率达到100%.综合研究表明,表达蛋白具有良好抗原性.     

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD- ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues)。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和 ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2%和39%，证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经Western blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性，表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。