转座子介导细胞质显微注射技术的基因转移效率比较

为了比较和探索SB(sleeping beauty)、PB(piggyBac)和T012 3种转座子介导下的细胞质显微注射法在小鼠(Mus musculus)和斑马鱼(Danio rerio)上的转基因效率,本研究将包含3种转座子的重组载体pT3-PST-CAG-GFP分别与3种转座酶表达载体以1:1质量比混合,显微注射至小鼠和斑马鱼受精卵细胞质,经体外培养后在胚胎发育不同时期用荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率,结果显示,在培养至4 Ed(96 h)(Ed: embryo day,胚胎发育的天数)的小鼠胚胎中,PB转座子介导的GFP转基因阳性率最高,达52％(N=281),显著高于SB的47％ (N=328)和To12的36％ (N=273)(P＜0.05);而受精后36和60 h (hour past fertilization,hpf)斑马鱼胚胎中,荧光显微镜检测表明,To12的GFP阳性率分别为36％(N=677)和37％(N=685),显著高于SB(28％ N=691和27％ N=708)和PB(30％ N=687和32％ N=675)(P＜0.05);转座子介导的细胞质显微注射可获得较高的转基因效率,且转座子活性具有物种差异性,在哺乳动物胚胎中PB转座子的基因转移效率最高,而在鱼类胚胎中To12转座子的基因转移效率最高.本研究为提高动物转基因效率研究提供重要参考资料.     

Sleeping Beauty (SB)转座子介导增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)体内转染鸡胚胎

为了探索转座子介导技术在鸡胚中的转染效果,本研究采用鸡蛋开窗法将Sleeping Beauty (SB)单质粒转座载体pT2-SV40-EGFP-SB11注射至孵化36 h鸡(Gallus domes ticus)胚盘中,同时设开窗不注射组和不开窗组.利用体视荧光显微镜和RT-PCR方法检测增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达率,并比较不同阶段的胚胎成活率、孵化率以及蛋重变化.结果表明,EGFP在鸡胚胎中获得较高的表达率(40％～89％);开窗组和不开窗组在胚胎发育早期蛋重变化差异不显著(P＞0.05),而后期开窗注射组的蛋重比例显著低于不开窗组(P＜0.05);三组胚胎的成活率和孵化率在整个发育过程中变化显著(P＜0.05).本实验初步证明了经改良的鸡蛋开窗法可用于鸡胚转基因研究,并初步建立了SB转座子介导外源基因在鸡胚中转染方法.     

睡美人转座子真核表达载体的构建及在猪胎儿成纤维细胞系中的表达验证

睡美人(sleeping beauty,SB)是Tc1/mariner转座子超家族的一员,为探索睡美人转座子与不同的转座酶搭配使用及与同种转座酶不同比例搭配使用时的转座效率,本实验构建了SB真核表达重组载体PT2-SV40-EGFP,通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测进行了猪胎儿成纤维细胞系(PEFs)转染条件优化研究.研究结果表明,不同转座酶与转座子按10∶1混合后细胞转染效率相似,但报告基因表达水平有较大差异,其中SB 100X转座酶与转座子混合后细胞的表达水平最高;转座子PT2-SV40-EGFP质粒和SB 100X转座酶质粒按不同比例混合转染细胞研究表明,细胞转染效率相似,但表达水平存在显著差异,其中1∶1组最高,约是5∶1组和10∶1组的50倍.本实验优化了睡美人转座子的转座条件为制备转基因动物深入研究提供参考.     

聚合酶Ⅱ转录的sRNA与RNA沉默抑制子对TMV病毒载体表达系统作用的比较

聚合酶Ⅱ介导合成的外源短链RNA(short RNA,sRNA)可以竞争性地抑制内源mRNA的核质转运,推测共表达sRNA可以间接地提高病毒载体表达系统的表达效率.为了验证这一假说和评价其应用潜能,本研究采用基因体外合成技术和亚克隆技术,分别构建了聚合酶Ⅱ转录的拟南芥U6-1 RNA和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)编码的RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressors,RSSs)2b的植物表达载体.以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)表达载体共接种寄主植物本氏烟(icotiana benthamiana),通过对报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的荧光观察,并以Western blot和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbnent assay, ELISA)测定GFP在烟草中的表达情况,分析sRNA对植物病毒载体表达系统的作用和可能的作用机制.同时通过与RSSs比较,评价sRNA在植物生物反应器中的应用潜能.实验结果表明,聚合酶Ⅱ转录的sRNA能有效地提高TMV病毒载体介导的外源基因在植物中的表达(GFP表达量比对照组高约2.5倍),而且能够显著地降低TMV诱导的病程相关蛋白2(Pathogenesis-related protein 2,PR2)在细胞内的积累水平(PR2表达量比对照组下降约8倍).推测Ⅱ型启动子转录的sRNA通过竞争性地抑制宿主抵御病毒入侵相关蛋白合成的mRNA核质运转促进病毒RNA介导的外源基因在植物中的表达.此外,Ⅱ型启动子转录的sRNA的作用效果与CMV病毒编码的RNA沉默抑制子2b相当.研究结果为提高病毒载体介导的外源基因在植物中的表达提供了一条可供借鉴的思路.     

超表达线粒体融合蛋白2基因(Mfn2)抑制小鼠卵母细胞体外成熟

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin2,Mfn2)参与细胞凋亡和细胞周期调控,在卵母细胞和胎盘发育中起着重要作用.本研究旨在探讨Mfn2基因对小鼠(Mus musculus)卵母细胞体外成熟过程的影响.从小鼠卵巢中克隆Mfn2基因并构建pMfn2-Venus真核表达载体.经脂质体2000介导重组质粒pMfn2-Venus转染293T细胞(病毒包装细胞),确认重组质粒在293T细胞内的表达及定位.将pMfn2-Venus体外转录为cRNA,并注射入小鼠卵细胞中,进行体外成熟培养,并统计卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD)发生率以及第一极体(first polarbody,PB1)排出率,荧光显微镜下观察其表达及定位.结果显示,注射了Mfn2-Venus cRNA的卵母细胞,其GVBD发生率以及PB1排出率与对照组相比显著降低(P＜0.0001,P＜0.05).本研究首次揭示了Mfn2基因对小鼠卵母细胞体外成熟过程的影响,为卵母细胞体外成熟的研究提供了一个新方向,同时也为研究减数分裂过程中Mfn2基因提供了一个平台.     

一种根癌农杆菌介导的GFP亚细胞定位方法的优化

利用根癌农杆菌介导的方法,采用CaMV 35S强启动子启动的含有GFP报告基因的双元表达载体pCAMBIA1301-35S-GFP-AZI1转化烟草表皮细胞。在激光共聚焦显微镜下进行观察,有绿色荧光产生。本文优化了GFP亚细胞定位的方法,即烟草为本氏烟草2～3周龄叶片,菌液OD600值为0.8,共培养时间为32 h,在此条件下能很好地进行GFP的亚细胞定位,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础。     

番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因,将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体,在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明,该基因定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的植物表达载体pCambia1301-EBF2,通过农杆菌介导方法转化MicroTom番茄。经PCR及GUS组织染色检测,外源基因已整合到番茄基因组中。     

利用不同基因转移方法构建转基因红鲤

本实验研究了大黄鱼肌肉生长抑素前肽基因对红鲤的促生长作用。分别通过RT-PCR和PCR从大黄鱼(Larimichtys crocea)和pIRES-EGFP质粒扩增得到了肌肉生长抑素(MSTN)前肽基因及核糖体内部进入位点序列(IRES)-增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)片段,经测序验证正确后,构建了Tol2转座子供体质粒pT2AL200R150G-MSTN propeptide-IRES-EGFP。通过精子介导法(S1、S2组)、电穿孔法(E1、E2组)及基因枪法构建转基因红鲤(Cyprinus carpio),孵化72h后的鱼苗经荧光显微镜检测,EGFP表达阳性率为:精子介导法S1组38%,精子介导法S2组48%,电穿孔E1组47%,电穿孔E2组53%,基因枪组2%;孵化10d的仔鱼RT-PCR检测EGFP和MSTN前肽基因阳性率为:精子介导法S1组35%,精子介导法S2组45%,电穿孔E1组45%,电穿孔E2组55%,基因枪组1.8%。孵化后75d转基因红鲤与对照组相比,体长和体重分别提高了21.31%和27.59%。本实验结果表明,精子经高渗、低渗保存剂处理并通过电穿孔作用可大幅提高基因转移效率。     

Tgf2转座子介导的草鱼、团头鲂和鲫插入诱变研究

转座子介导的插入诱变(insertional mutagenesis)策略在养殖鱼类功能基因发掘和解释方面有着重要的研究意义。本研究以高效Tgf2转座子为研究基础,构建了pTgf2-β-actin-eGFP、pTgf2-EF1α-eGFP、pTgf2-Myo D-eGFP和pTgf2-Krt8-eGFP这4种带有不同启动子的供体质粒,以及pCS2-gf TP这种gf TP转座酶mRNA的体外表达的辅助质粒。将供体质粒和gf TP转座酶mRNA一起注射到草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)和鲫(Carassius auratus)的1~2细胞期受精卵中,经对子代增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)整合率的检测和筛选,初步构建了1个以转座子为工具介导的插入诱变库。实验表明,在早期胚胎中,鲫和团头鲂的荧光率达到90%,在草鱼中则高达95%,随着供体质粒注射的改变,表现出肌肉、表皮及全身不同的绿色荧光发光特征。eGFP基因平均整合率在3种鱼类子代平游期的为50%~53%,在1龄阶段为33.0%~36.1%。在3种鱼类中得到插入诱变突变体,获得草鱼阳性个体162尾,其中有45尾表型明显差异;鲫阳性个体60尾,其中有14尾表型明显差异;团头鲂阳性个体51尾,其中有10尾表型明显差异。结果表明,通过插入Tgf2转座子,可在草鱼、团头鲂和鲫等鲤科鱼类中实现基因组的插入诱变,本研究结果可为目标性状功能基因的挖掘和功能机制研究积累一定的基础。     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。     

大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选

大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用.为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系.设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3.并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果.并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选.结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45％(P＜0.01)、8.57％(P＜0.01)和8.71％(P＜0.01);干扰效率为39％(P＜0.05)、64％(P＜0.01)及68％(P＜0.01).稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43％(P＜0.05)、78％(P＜0.01)及91％(P＜0.01).干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系.本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料.     

中间锦鸡儿CiMYBJ2基因克隆及表达分析

MYB转录因子是植物体内最大的转录因子家族之一,参与植物生长发育的调控、对逆境的响应等生理过程。本研究通过RACE技术从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)中克隆了一个MYB转录因子Ci MYBJ2(Gen Bank登录号:KJ937783),并对其在植物中的表达及其启动子进行了初步研究。本研究克隆得到该基因c DNA全长1 368 bp,3'UTR长196 bp,5'UTR长203 bp。其中开放阅读框长969 bp,编码一个含322个氨基酸的亲水蛋白。g DNA序列长1 285 bp,有2个内含子和3个外显子。采用实时荧光定量PCR技术分析了Ci MYBJ2的表达模式,结果发现,在高温、脱水、Na Cl、干旱等处理条件下,Ci MYBJ2基因对不同胁迫均有响应。在高温处理后,Ci MYBJ2基因的表达量在1和3 h明显降低,之后维持一个较低值,在不同时间点基因表达量与0 h相比差异均达到极显著水平(P0.01);在脱水处理1 h后Ci MYBJ2基因的表达量上升,且与0 h相比差异极显著(P0.01),然后逐渐降低,在3 h Ci MYBJ2基因的表达量与0 h相比差异不显著(P0.05),在8和12 h该基因的表达量与0 h相比差异均达到极显著(P0.01),在24 h的表达量是0 h的一半,且差异显著(P0.05);在Na Cl处理1 h后Ci MYBJ2基因的转录水平开始增加,3 h达到最高,之后总体呈下降趋势,在8 h表达量最低,在1、3、8和24 h该基因的表达量与0 h相比差异极显著(P0.01),在12 h Ci MYBJ2基因的表达量与0 h相比差异不显著(P0.05);干旱处理6 d后,Ci MYBJ2基因的表达量上升,之后一直下降,且与0 d相比差异达到极显著水平(P0.01),15 d表达量最低。研究结果暗示Ci MYBJ2基因可能在植物对胁迫的响应过程中起作用。利用染色体步移技术克隆了中间锦鸡儿Ci MYBJ2基因启动子序列,长度为873 bp,分析显示,该启动子具有响应多种非生物胁迫的顺式作用元件。研究结果为进一步研究Ci MYBJ2基因功能和表达调控提供了依据。     

奶牛SREBP1蛋白对FASN基因启动子的转录调控分析

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是动物组织合成脂肪酸的关键酶,为研究奶牛(Bos taurus)FASN基因的调控机制,本研究从奶牛基因组DNA中克隆构建了3个不同片段长度的FASN基因启动子并分析其结构,在L02肝脏细胞中转染固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein1,SREBP1)真核表达载体和FASN启动子,Western blot检测SREBP1核蛋白的表达,双荧光素酶系统和q RT-PCR技术研究对FASN基因启动子活性的调控作用,结果发现,构建的pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子片段长度分别为177、255和399 bp,其中pGL3-FASN2和pGL3-FASN3包含SREBP1转录因子结合位点。在人(Homo sapiens)源L02肝脏细胞中转染SREBP1质粒后检测发现,SREBP1核蛋白表达升高。肝脏细胞中转染pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子并用SREBP1质粒处理后,pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子活性极显著增加(P0.01)。与对照组相比,SREBP1处理后细胞FASN基因m RNA的表达显著增加1.67倍(P0.05)。本研究揭示奶牛SREBP1蛋白可以促进对FASN基因的转录激活。这一结果为研究奶牛FASN基因的转录调控机制提供了基础资料。     

牛肌细胞生成素基因(MyoG)启动子的活性及组织特异性分析

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用。为了研究牛(Bos)MyoG基因启动子的启动效率和组织特异性。本研究首先克隆了牛MyoG基因启动子区域,以pDsRed2载体为外源载体,红色荧光蛋白为目的基因,构建了pDsRed-BosMyoG真核表达载体。利用脂质体介导转染体外培养的绵羊(Ovis aries)骨骼肌卫星细胞和成纤维细胞,最后通过实时定量PCR和Western blot检测红色荧光蛋白的表达,从而确定牛MyoG基因启动子的启动效率及组织特异性。结果显示,pDsRed-BosMyoG转染绵羊骨骼肌卫星细胞后在显微镜下可观察到红色荧光蛋白的表达,但在转染后的成纤维细胞中并没有观察到红色荧光蛋白的表达。在mRNA水平上,转基因骨骼肌卫星细胞中红色荧光蛋白mRNA表达量明显高于转基因成纤维细胞(P0.01)。Western blot结果显示,转基因骨骼肌卫星中高表达红色荧光蛋白,而在转基因成纤维细胞中并未检测到此蛋白。结果表明,本研究克隆得到的牛MyoG基因启动子可以特异性的在绵羊骨骼肌卫星细胞中驱动外源基因的高表达,是一种有效的肌肉细胞特异性启动子。克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为改良家畜肉质研究提供实验依据。     

非生物胁迫下W-box突变对小麦TaGAPC5基因启动子活性的影响

小麦(Triticum aestivum)胞质甘油醛3-磷酸脱氢酶(cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPC)Ta GAPC5基因在干旱等非生物胁迫下显著表达。序列分析表明,Ta GAPC5基因启动子区包含3个W-box顺式作用元件。本实验利用PCR定点突变技术对Ta GAPC5基因启动子区-640处W-box单独突变、-640、-700两处W-box突变和-640、-700、-997处W-box均突变,将这3种突变的启动子分别与植物表达载体p C0390-GUS融合表达,利用农杆菌(Agrobaoterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum),对转化后的烟草分别进行正常条件下培养和100 nmol/L脱落酸(abscisic acid,ABA)、20%PEG8000胁迫处理。组织化学染色结果显示,这3种突变后的启动子序列均具有一定的启动子活性。烟草叶片GUS酶活检测结果表明,在正常生长条件下,Ta GAPC5基因启动子-640处W-box单独突变对启动子活性影响不大,-640、-700、-997三处W-box均突变Ta GAPC5基因启动子活性显著降低(P0.01);在100 nmol/L ABA诱导下,-640处W-box单独突变、-640、-700两处W-box突变和-640、-700、-997处W-box均突变均可显著降低Ta GAPC5基因启动子活性(P0.01);在PEG胁迫条件下,Ta GAPC5基因启动子-640处W-box单独突变和-640、-700、-997三处W-box均突变可显著降低该基因启动子活性(P0.01)。因此表明-640、-700、-997处W-box对小麦Ta GAPC5基因启动子活性有一定影响,其中在100 nmol/L ABA、20%PEG8000胁迫条件下其影响较大,推测Ta GAPC5基因启动子序列中W-box元件可能参与非生物胁迫下小麦Ta GAPC5基因的表达调控。这一研究结果可为小麦Ta GAPC5基因在非生物胁迫下的表达调控研究提供重要线索。     

基因枪法介导的辣椒花药遗传转化技术研究

为建立基因枪法介导的辣椒遗传转化体系,以小孢子胚胎发生率较高的辣椒品种L5的花药为受体,利用基因枪法将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入L5花药小孢子中,并进行花药培养诱导小孢子胚胎发生,探讨基因枪法转化辣椒花药小孢子的适宜参数。结果表明,辣椒小孢子处于单核靠边期的花药在9℃下暗培养4 d时为最佳受体;CaMV35S启动子能启动GFP基因在辣椒花药培养的小孢子胚胎中表达;基因枪各轰击参数对小孢子胚胎发生有显著影响(P0.05),随着基因枪轰击次数和轰击压力的增加以及轰击距离的减小,小孢子胚胎发生数量逐渐减少;最适的轰击参数为基因枪轰击2次、轰击压力1 350 psi和轰击距离9 cm,此时获得的转化胚胎数量最多;在最适的轰击参数下辣椒花药小孢子的平均转化效率为4.2%;体式荧光显微镜下共检测到14个转化胚胎。本研究结果为进一步建立基因枪介导的辣椒花药稳定遗传转化体系提供了一定的理论基础和技术支撑。     

多粘类芽胞杆菌菌株M-1启动子片段的克隆及绿色荧光蛋白的表达

应用启动子探针载体pECE7,从多粘类芽胞杆菌（Panebacillus polymyxa）菌株M-1基因组克隆到一系列启动子活性片段,通过氯霉素（chloramphenicol chloromycetin,Cm）浓度梯度筛选出Cm抗性较强的3个片段。将这3个具有启动子活性的片段与来自GFP表达载体pGFP78的gfpmut3a基因插入Escherichiacoli-Bacillus穿梭载体pHY300PLY中,获得GFP表达载体pGFP5,pGFP8和pGFP17。通过热激转化E.coliDH5α,荧光显微镜下观察到明亮的绿色荧光,表明筛选到的启动子片段具有良好的启动外源基因gfp转录的功能。同时利用此表达载体标记本实验筛选得到的生防蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）菌株B905,获得了GFP标记的工程菌Bacillus cereus B905（gfp-5、gfp-8和gfp-17）,通过荧光显微镜观察,发现转入GFP表达载体pGFP5和pGFP8后,菌体有明亮的绿色荧光,而转入pGFP17的菌体荧光相对较弱。     

小金海棠类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)启动子的克隆与表达

为探明小金海棠(Mdus xiaojinensis)类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)的表达和调控机制,应用Tail-PCR技术从小金海棠中克隆了翻译起始位点上游891 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件、乙烯应答元件、赤霉素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件.以GFP为报告基因,构建了含MxYSL5基因启动子的植物表达载体MxYP5-GFP.将MxYP5-GFP用基因枪法转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,瞬时表达结果表明,该启动子能够驱动GFP在洋葱表皮细胞中的表达,可以用于MxYSL5的表达示踪.     

小金海棠Fe3+-螯合还原酶MxFRO2基因启动子的克隆与表达分析

通过染色体步移法从小金海棠（Malus xiaojinensis）基因组中克隆了三价铁螯合还原酶（ferric chelate reductase, MxFRO2）基因翻译起始位点上游1 738 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件G-box、生长素应答元件、铜元素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。从TAIR网站获得了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中8个FRO基因上游的启动子序列,通过PlantCARE分析了其与MxFRO2启动子的异同。根据在线预测结果,克隆了翻译起始位点上游1 644 bp（MxFul）和259 bp（MxD1）两段序列,构建了其与GFP融合的瞬时表达载体,并将重组质粒通过PEG介导法分别转化拟南芥叶片原生质体,结果表明,小金海棠MxFul和MxD1两段启动子序列都能驱动GFP蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达。