牡丹实时定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR(qPCR)是目前研究基因定量表达的重要方法,根据特定实验材料及条件选择qPCR分析中合适的内参基因对于准确校正目的基因的表达至关重要。本研究以牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)不同组织(根、茎、叶和花瓣)、切花开放不同时期及不同处理(乙烯或葡萄糖处理)的花瓣为材料,利用qPCR技术探讨了5种常用看家基因:β-微管蛋白基因(β-tubulin)、泛素基因(ubiquitin)、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(GAPDH)、肌动蛋白基因(actin)及18S核糖体RNA(18S rRNA)的表达情况,各看家基因均能特异扩增并显示较高的扩增效率。经geNorm和NormFinder程序统计学计算处理,综合分析结果显示,在牡丹不同组织或切花开放不同时期花瓣中,ubiquitin表达最为稳定;在不同处理的切花花瓣中,GAPDH表达最为稳定,二者分别适宜作为相应条件下的内参基因。本研究认为,各实验条件下使用ubiquitin和GAPDH两个表达最稳定的基因组合,即可获得更为精确的基因表达结果。本研究结果对牡丹中关键基因的定量表达分析具有重要的实用价值。     

仔猪组织基因表达中实时定量PCR内参基因的选择

实时定量PCR研究中需要选择表达稳定性高的内参基因才能准确地校正目标基因的表达量。以仔猪不同组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了beta-肌动蛋白（ACTB）、beta-2-微球蛋白（B2M）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、羟甲基胆素合成酶（HMBS）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT1）、核糖体蛋白L4（RPL4）、琥珀酸脱氢酶（亚基A）（SDHA）、TATA盒结合蛋白1（TBP1）和酪氨酸3-单氧化酶/色氨酸5-单氧化酶激活蛋白zeta多肽（YWHAZ）共9个看家基因mRNA水平的表达情况。经geNorm程序统计学分析处理,结果表明,9个看家基因的表达稳定性为HMBS和HPRT1〉RPL4〉TBP1〉B2M〉YWHAZ〉SDHA〉GAPDH〉ACTB,确定了HMBS基因在仔猪不同组织中用于校正目标基因的表达量为最佳选择,而RPL4基因则可以作为高转录本的内参基因。     

大黄鱼microRNA荧光定量PCR中内参基因的选择与评价

为筛选适用于大黄鱼miRNA研究的内参基因,选取饥饿试验组(EG)中饥饿21d及正常投喂组(CG,对照)的大黄鱼肌肉组织进行miRNA高通量测序,初步筛选得到稳定表达的6个miRNA:miR-23a-3p,miR-4508,miR-1961,miR-1297,miR-1956-3p和Let-7。采用实时荧光定量PCR法检测这6个miRNA和3个传统的内参基因(U6,5S和18S)在大黄鱼6种组织(肌肉、肝脏、肾、脾、脑和心脏)以及不同饥饿时间段的肌肉组织中的表达,并利用Ge Norm,Best Keeper以及Norm Finder对数据进行分析。结果表明,miRNA的表达稳定性优于传统内参基因。在CG组大黄鱼不同组织中,最稳定单内参基因是miR-23a-3p,最佳内参基因组合为miR-23a-3p和Let-7。在不同饥饿时间的EG组大黄鱼肌肉组织中,最稳定单内参基因是miR-23a-3p,最佳内参基因组合为Let-7和miR-1961。本试验结果为研究大黄鱼miRNA时内参基因的选择提供了参考。     

小麦条锈菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件.基于现有对内参基因的研究,本研究挑选出10个基因作为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)的候选内参基因.经过PCR扩增效率筛选,8个基因符合要求可用于稳定度的筛选,这些基因包括泛素连接酶(UBC、泛素连接酶E2(UBCE2)、核糖体蛋白SS(RPS5)、α微管蛋白(TUBA)、β肌动蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、延伸因子1(EF1)和延伸因子3(EF3).本研究以两种小麦条锈菌(CYR32和Pst78)的夏孢子、萌发芽管分别接种两个小麦(Triticum aestivam)品种(CYR32/XZ9104和Pst78/AvS)后0.5、3和14 d的样品为材料,利用实时荧光定量PCR技术,检测了这8个持家基因在不同发育阶段的小麦条锈菌中的表达情况.经geNorm软件分析发现,3个持家基因在样品中的表达趋势与小麦条锈菌的侵染过程相符合.ACTB、TUBB和TUBA的组合可作为检测小麦条锈菌基因表达的内参基因.     

铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择

豆科植物-根瘤菌共生体系因固氮能力卓越,肥土效应明显,常被作为先锋植物进行环境修复。利用qRT-PCR分析铜胁迫下天蓝苜蓿(Medicago lupulina L.)与根瘤菌(Sinorhizobium meliloti,CCNWSX0020)共生固氮过程中差异基因时,由于环境中铜离子差异可能使持家基因表达不稳定,因此需要筛选合适的持家基因作为内参。本研究选取8个天蓝苜蓿的持家基因(肌动蛋白(beta actin,ACT)、组蛋白(histone H2A,H2A)、核糖体蛋白18S(ribosomal 18S,18S)、微管蛋白(tubulin beta,TUB)、泛素连接酶(ubiquitin,UBI)、延伸因子1(elongation factor 1,EF1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和亲环蛋白(cyclophilin,CYP))作为候选内参基因,人工模拟不同水平铜(浓度分别为50、100、150和200 mg/kg)污染,以接种根瘤菌后30 d的天蓝苜蓿根为材料,筛选最佳内参基因。经引物特异性及PCR扩增效率检测,各候选内参基因引物均符合稳定性筛选要求。荧光定量PCR分析结果表明,8个候选内参基因的表达水平和稳定性随铜离子浓度不同而呈现差异。在线评估所有样品中候选内参基因表达稳定性,结合geNorm软件分析最佳内参基因组合数目,结果发现,最适内参基因组合为GAPDH和EF1;分别在线评估不同铜浓度处理下候选内参基因表达稳定性,结果表明,低浓度铜(≤50 mg/kg)处理下最佳内参基因为GAPDH,中高浓度铜(≥100 mg/kg)处理时最佳内参基因为UBI。本研究结果为铜胁迫下天蓝苜蓿共生结瘤过程中差异基因的表达分析提供了基础资料,同时为其他重金属胁迫下内参基因的筛选提供了参考和借鉴。     

利用实时荧光定量PCR筛选新蚜虫疠霉内参基因

内参基因的准确选择是利用实时荧光定量PCR进行准确分析基因相对表达量的前提。虫霉目真菌新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)是重要蚜科专化性病原真菌,经常引发多种作物上蚜虫种群的流行病。本研究通过实时荧光定量PCR分析了新蚜虫疠霉ARSEF 5403中3个传统管家基因18Sr RNA(18S)、28Sr RNA(28S)和延伸因子1α相似蛋白(elongation factor-1 alpha-like protein,EF1)m RNA表达差异情况,并利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件综合分析了其在4个生长阶段(分生孢子、萌发管时期、短菌丝和长菌丝)和3种营养条件(GLEN培养基、OS-SDB培养基和Grace培养基)下表达的稳定性。结果表明,基于公共数据库序列设计的候选内参基因的引物具有良好的扩增效率和特异性。经ge Norm软件分析,新蚜虫疠霉在不同生长阶段和不同营养条件下3个候选内参基因的平均表达稳定性(M值)分别为:18S(0.457)28S(0.534)EF1(0.749)和18S(0.389)28S(0.557)EF1(0.607)。利用Norm Finder软件分析,新蚜虫疠霉不同生长阶段和不同营养条件下3个候选内参基因的平均M值分别为:18S(0.084)28S(0.264)EF1(0.509)和18S(0.118)28S(0.355)EF1(0.403)。而Best Keeper软件分析得到的稳定性等级有所差异,在不同生长阶段和不同营养条件下候选内参基因28S表达最稳定,18S次之,EF1最不稳定。综合分析3款软件对荧光定量PCR结果的稳定性等级的平均值,得出在不同生长阶段和不同营养条件下候选内参基因18S表达最为稳定。筛选出的18S可作为分析新蚜虫疠霉基因表达差异的一个较为可靠的内参基因,同时为后续研究新蚜虫疠霉的生长、毒力相关基因的表达分析研究提供技术支持。     

冬瓜实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为筛选适合冬瓜稳定表达的内参基因,以黑皮冬瓜低温、高温、干旱胁迫处理不同时间的叶片和正常处理不同组织为试验材料,利用RT-qPCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价7个候选内参基因(28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、GAPDH、EF-1α、UBC21和TUA)稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同组织和不同胁迫处理下表达丰度及稳定性存在差异; EF-1α在低温胁迫处理下表达稳定性最好;UBQ和TUA在高温和干旱胁迫处理下表达稳定性最好; EF-1α 在不同组织中表达稳定性最好。本研究结果为冬瓜内参基因的选择提供了一定的理论参考。     

扇脉杓兰实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出扇脉杓兰实时荧光定量PCR(RT-qPCR)中最适内参基因,以扇脉杓兰幼根、茎、叶、唇瓣、种子为研究材料,利用RT-qPCR技术检测12个常见看家基因TIF3I1、CYP22、RPS4、UPL1、UBC2、TUBB3、RPL26B、RAN1、SAMDC、ACT3、PP2A3和EF1的表达情况,结合geNorm、...     

西南鸢尾花色变异实时定量PCR内参基因的筛选与验证

为筛选适用于不同花色西南鸢尾花色合成途径相关基因表达分析的内参基因,本研究根据西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾花蕾组织的转录组测序数据,筛选了6个常用内参基因(ɑ-TUB、β-TUB、AQP、ACT、GAPDH、UBQ),同时以百合18S做为对照内参基因,在西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾的花蕾组织中,分别通过反转录PCR(RT-PCR)初筛和RT-qPCR检测表达量,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行评价。RT-PCR初筛结果显示,7个候选内参基因引物的特异性均较好,在6个样品间没有明显差异;RT-qPCR分析表明,7个候选内参基因的表达量存在一定差异,其中18S表达量最高,UBQ最低;geNorm、NormFinder和BestKeeper分析结果表明,ACT表现最稳定,最适合做为内参基因,β-TUB相对稳定性最低;以Actin为内参对西南鸢尾类黄酮/花青素和类胡萝卜素2类色素合成途径中部分相关基因的RT-qPCR分析结果与转录组测序结果相一致。本研究为鸢尾属植物花色素合成相关基因表达分析内参基因的筛选以及鸢尾属植物资源利用和花色育种研究提供了理论参考。     

黄秋葵实时荧光定量PCR内参基因的克隆与筛选评价

为筛选黄秋葵实时荧光定量PCR的稳定内参基因,本研究以绿白1号为试验材料,根据黄秋葵RNA-seq数据库,筛选并验证获得18SrRNA、ACT、EF-1α、TUA、TUB、GAPDH等6个内参基因ORF序列;以黄秋葵不同组织、不同发育时期果实、不同发育时期叶片和低温、高温、干旱胁迫处理的叶片为材料,利用实时荧光定量PCR技术分析测定基因表达量,并结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价6个内参基因的稳定性。结果表明,6个基因在不同组织、各发育阶段及不同胁迫下均有表达,但表达稳定性不尽相同,其中,EF-1α在黄秋葵果荚发育、高温胁迫下表达稳定性最好;18SrRNA在黄秋葵各组织、叶发育和干旱胁迫下表达稳定性最优;ACT在低温胁迫下表现最稳定。此外,在29个处理中,18SrRNA、EF-1α、ACT表达均较稳定,可以用于荧光定量表达分析。本研究结果为黄秋葵基因功能分析和调控机理研究提供了基础。     

非生物胁迫下多年生黑麦草qRT-PCR分析中内参基因的选择

提高实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)准确性的先决条件是选择表达稳定性较高的内参基因。本研究以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)为材料,利用q RT-PCR技术检测翻译起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4 alpha,e IF4A)、TNF结合蛋白Ⅰ(Tat binding protein-1,TBP-1)、泛素连接酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、生物钟受体蛋白(zeitlupe,ZTL)和甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)6个候选内参基因在不同非生物胁迫下的表达情况。运用ge Norm(ver.3.5)、Normfinder(ver.0.953)、Best Keeper(ver.1.0)、Delta Ct和Ref Finder软件综合分析表明,在干旱、盐、热胁迫及ABA处理下,e IF4A基因表达稳定性最高;在涝胁迫下,UBQ基因表达稳定性最高。因此,e IF4A和UBQ候选基因可作为不同胁迫下的内参基因,为进一步开展多年生黑麦草基因表达的定量研究了提供了一定的理论依据。     

丝瓜18S rRNA基因克隆及其作为内参基因的应用

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(q RT-PCR)准确性的重要条件。18S r RNA基因表达范围广、表达量恒定,常作为内参基因应用于实时荧光定量PCR中。为了获得丝瓜18S r RNA基因,并设计合适的荧光定量PCR内参引物,解决丝瓜实时荧光定量PCR检测中无内参基因的现状,通过PCR和序列测定,首次克隆到了丝瓜的18S r RNA基因序列,其长度为1 862 bp,Gen Bank登录号为KM656452。在此基础上设计1对荧光定量PCR引物,该引物特异性强,扩增效率高,在丝瓜各生长发育阶段及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达,适合在丝瓜基因表达研究中作为内参基因。该研究结果可为开展丝瓜重要功能基因的表达模式和调控机制的研究奠定基础。     

狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。     

实时荧光定量PCR技术在转基因猪生长激素基因差异表达中的应用

为确定猪生长激素基因(pGH)在F1代转基因猪体内的遗传稳定性及其在育肥初期表达水平的差异,利用SYBRGreenⅠReal-time PCR法检测精子介导纳米基因载体法获得的F0代母猪与非转基因公猪配种所产的7头转pGH基因猪和9头非转基因猪3月龄生长激素的表达水平。根据16个血液样品荧光定量结果绘制溶解曲线和扩增曲线图谱,并用F=(1+E)﹣ΔΔCt,公式进行Ct均值的分析,得出F1代转pGH基因猪生长激素平均表达水平是同期非转基因猪的1.77倍。结果证实,1)外源pGH基因在转基因猪体内能稳定传代;2)并非每头转基因猪体内pGH基因的表达量均高于非转基因猪;3)在F1代转基因猪体内,pGH的平均表达水平显著高于同期非转基因猪。本实验建立了能够稳定测评家猪生长激素相对基因表达水平的方法,为研究转基因与非转基因动物之间生理指标与定量表达的差异性等提供了科学依据。     

西尼罗病毒荧光定量PCR检测体系的建立及评价

本研究建立了一种实时荧光定量PCR快速核酸检测西尼罗病毒的方法。通过序列比对和blast分析，确定西尼罗病毒Caspid蛋白保守区基因为检测的目的基因，引物采用Primer Premier5.0软件进行设计。本研究建立的检测方法利用SYBR Green染料，相比探针成本较低。通过溶解曲线分析表明，建立的检测方法在扩增过程中没有发现有二聚体的产生。本检测体系在用空白对照及类似的乙脑病毒作为扩增对照时，没有发现非特异性产物的生成，表明该体系对于西尼罗病毒的检测是特异的。将阳性对照标准品进行10倍梯度稀释后可检测到102copies/μL样品，表明该检测体系具有较高的检测灵敏度。     

磷化氢诱导下赤拟谷盗实时定量PCR内参基因的筛选

实时定量RT-PCR(qRT-PCR)是进行基因表达水平分析的一种常用技术手段,而选择相对稳定的内参基因对数据进行标准化是获得可信数据的关键。本研究使用qRT-PCR技术评价8个内参基因—β-actin、GAPDH、α-Tubulin、SYN1、SYN6、RPS3、RPS18和RPL13a在磷化氢诱导后的不同品系赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中的表达水平,采用相对定量方法并分别使用geNorm和NormFinder程序进行数据分析。其中经geNorm软件分析的8个内参基因的稳定性由高到低排列顺序为RPS18=RPL13a(0.007)SYN6(0.015)RPS3(0.038)β-actin(0.044)α-Tubulin(0.105)SYN1(0.154)GAPDH(0.205),且内参基因配对差异值V2/3值为0.006,从而确定内参基因的最适数目为2个,分别为RPS18和RPL13a。NormFinder与geNorm相似,其运行结果以稳定值的大小排序,经NormFinder分析的各内参基因的稳定性由高到低的排列顺序为RPS18(0.002)RPL13a(0.016)β-actin(0.042)RPS3(0.044)SYN6(0.055)α-Tubulin(0.066)SYN1(0.077)GAPDH(0.126),由此得出RPS18的稳定性最高,最终由该程序判定的最佳组合是RPS18和RPL13a。因此,geNorm和NormFinder两款软件的分析结果一致,最终确定相对适合的内参基因有两个:RPS18和RPL13a,该结果为赤拟谷盗基因的表达研究提供了基础资料,也为其他昆虫内参基因的筛选提供参考。     

实时荧光PCR检测转基因大豆外源基因的拷贝数

快捷、准确地检测转基因植物中外源基因的拷贝数,是转基因生物育种的重要研究内容,具有较大的应用前景。本研究以7个抗虫BT(Bacillus thuringiensis)和抗草甘膦EPSPS-G10转基因大豆事件为材料,以SYBR Green I为荧光染料,利用实时荧光定量PCR方法,根据PCR反应获得的Ct值与起始模板数的对数值存在线性反比关系这一原理,建立了相关性系数在0.99以上的模板定量标线。通过目的基因与内参基因——大豆肌动蛋白编码基因ACTIN的起始模板量比较,估算出各株系的目的基因拷贝数。数据显示,株系1、2、3和4的2个基因均为单拷贝,株系6的2个基因均有2个拷贝,株系5和7的2个基因的拷贝数为3。利用Southern印迹方法对材料1~4的拷贝数进行验证,结果表明,两者的检测结果基本一致,证明实时荧光PCR检测法是大豆外源基因拷贝数检测中快速有效的方法。实时荧光PCR高效快速检测基因拷贝数,对于大规模转基因株系的外源基因拷贝数检测应用具有重大意义。     

实时荧光定量PCR技术在本科实验教学中的应用探讨

针对农林专业教学的特点,设计了"实时荧光定量PCR分析不同氮肥施用量下烟叶团棵期叶片中NtCIPK8的定量表达"实验,使学生了解不同施氮量下,相同组织中同一个基因的表达量不同的知识,还将基因表达的特点从一个抽象的概念转化为了具体的数字图形,同时使学生可以掌握实时荧光定量PCR技术的原理、方法和仪器的使用,为增强农林专业...     

基因宏阵列和荧光定量PCR方法对西瓜枯萎病害土壤中尖孢镰刀菌的快速检测和定量

采用基因宏阵列(Macroarray)和荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法,对引起西瓜枯萎病害的病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行了快速监测和快速绝对定量,并且对实验条件进行了优化和摸索。结果显示,在西瓜枯萎病害发病较为严重的处理N-+P-和N-+P+的根际土壤中,Macroarray检测到强烈的阳性信号,表明尖孢镰刀菌的大量存在,同时荧光定量PCR的结果也表明在这两个处理的根际土壤中尖孢镰刀菌数量最多,分别为每g土壤8.89×105和2.24×105个拷贝数;而在未发生枯萎病害的处理N++P-和N++P+中,Macroarray未检测到阳性信号,根际土壤中尖孢镰刀菌数量分别为每g土壤6.23×103和3.28×103个拷贝数;而四个处理的土体土壤中尖孢镰刀菌的数量均维持在每g土壤102～103个拷贝数,Macroarray未检测到阳性信号。与传统检测方法如病原菌的分离培养、平板稀释计数等相比,上述分子生物学方法对病原真菌的检测和定量更为准确快速、省时省力。