油菜素内酯合成酶基因表达与葡萄果实发育关系研究

为研究葡萄早熟机制,以鄞红葡萄及其3株成熟期较早的变异株系甬紫晶、甬早红与甬妃红为材料,测定植株不同发育时期油菜素内酯(BRs)的含量以及其生物合成途径中的关键酶基因的表达量。结果表明,甬紫晶与甬早红的BRs含量高峰期早于鄞红,甬妃红的BRs含量略高于鄞红,这可能是影响早熟的主要因素;相关性分析表明,在葡萄果实生长发育过程中,BRs含量与DET2和CPD 2个基因的表达量正相关,DET2可能是BRs生物合成过程中的关键酶,CPD对BRs生物合成起辅助作用。本研究结果对葡萄成熟调控等实际生产具有重要的指导意义。     

亚洲棉中与棕色素合成相关基因GaTT12a的克隆及表达特征

棕色棉具有典型的自然棕色纤维,在纺织及加工过程中无需漂染,是真正的“生态”、“环保”棉.克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因对于揭示棉花纤维色素发育的分子机理具有重要的意义.本研究选取亚洲棉(Gossypium arboreum)棕色纤维慈溪紫棉和白棉余姚中棉纤维发育不同阶段RNA,采用Gene Fishing技术,获得1条仅在亚洲棉棕色棉纤维中特异表达的约500bp的PCR扩增产物,根据测序结果和生物信息学分析发现,该基因在核苷酸序列上与拟南芥(Arab idopsis thaliana)种皮棕色素合成TT12基因存在76％的序列同源性.随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因,命名为GaTT12a(GenBank登录号:JX013908),该基因编码490个氨基酸残基,分子量约52.7 kD,属于MATE超基因家族中的一个成员.利用荧光定量PCR分析了GaTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮的表达特征,结果表明,GaTT12a基因在棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达,在白色棉纤维中几乎不表达,说明该基因参与纤维棕色素的形成,结果暗示棉花种皮棕色素和纤维棕色素可能分享相似的合成代谢途径.研究结果为进一步了解GaTT12a基因参与棕色棉纤维色素形成、棕色棉纤维色素与种皮棕色素合成之间的关系提供了基础研究资料.     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。     

油菜素内酯对水稻细胞伸长和分裂的调控

油菜素内酯(brassinosteroid,BR)是调控植物生长发育的重要的激素之一。为明确BR在调控水稻(Oryza sativa)细胞发育过程中的作用,本研究以不同浓度外源BR处理的水稻愈伤组织、悬浮系和内源BR信号增强的BR突变体Os BZR1-OE为材料,对BR处理后水稻愈伤组织的体积和细胞分布状况、单个悬浮细胞的形状和大小、Os BZR1-OE转基因水稻的细胞进行了观察,并对细胞分裂关键基因的表达量、对细胞分裂具有重要作用的细胞骨架蛋白(F-actin)的积累进行了分析。结果表明,低浓度(1×10-10 mol/L)BR处理的愈伤组织块体积(1.03 cm3)大于对照(0.73 cm3),但高浓度BR(1×10-6 mol/L)处理的愈伤组织块的体积(0.27 cm3)明显小于对照;从细胞核的分布也能印证上述结果,低浓度BR处理后的愈伤组织细胞核排列疏松,表明细胞体积较大,即1×10-10 mol/L BR促进了水稻愈伤组织细胞体积的增加,高浓度BR处理后的愈伤组织细胞核密度大,表明细胞体积较小,即1×10-6 mol/L BR抑制了水稻愈伤组织细胞体积的增加;低浓度BR促进水稻悬浮系单个细胞的伸长,而高浓度的BR抑制悬浮系细胞的伸长;内源BR信号增强的突变体Os BZR1-OE下胚轴细胞明显短于野生型水稻下胚轴细胞;本研究通过碘化丙碇(propidium iodide,PI)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomerⅠ,FITC)-鬼笔环肽染色对悬浮系细胞的形态和微丝细胞骨架进行观察,发现BR处理可促进水稻悬浮系细胞和微丝骨架的分裂,高浓度BR对细胞分裂的促进效果更明显;双向电泳结果表明,BR处理可促进微丝骨架蛋白的表达;RT-PCR结果表明,BR可增加促进有丝分裂的CDC48(cell division cycle protein 48)和能缩短细胞周期的CYCD2(cyclin D2)基因的表达。上述结果表明,低浓度BR促进水稻细胞的伸长,高浓度BR抑制水稻细胞的伸长,BR促进微丝骨架F-actin的积累,通过促进有丝分裂基因CDC48和缩短细胞周期的因CYCD2的表达而调控水稻细胞的分裂。本研究为BR在作物控高抗倒伏方面的应用提供了理论依据。     

油菜毛状体发育相关基因GLABRA2启动子的克隆与功能验证

GLABRA2(GL2)基因在拟南芥毛状体发育中具有重要作用.实验利用基因组步移巢式PCR的方法,通过两次步移克隆得到一个油菜(Brassica napus)GL2基因启动子序列,序列分析发现它与拟南芥GL2启动子同源性较差,但有一些共同的顺式作用元件如MYB结合位点、G box等,也有油菜GL2基因所特有的应答元件如E-box.将其中具有启动子的基本特征的序列GP1与GUS报告基因融合构建重组载体pBI121-GP1,转化拟南芥(Arabidopsis).用卡那霉素筛选得到10株阳性苗.在T2代转基因株系中有6个株系的绿苗与黄花苗的比例都接近3:1,推定T-DNA是以单拷贝的形式插入拟南芥基因组DNA.GUS组织化学染色表明,GP1调控下报告基因主要在子叶、真叶的表皮毛以及根部的幼嫩组织中表达,与拟南芥GL2基因启动子表达模式基本一致,但也有明显不同:油菜GL2启动子GP1只在表皮毛发育早期强烈表达,而拟南芥GL2启动子调控表皮毛发育的整个过程.     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达研究

根据Genbank上发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了由2个外显子和1个内含子组成的鹅脂联素基因。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3 Da、5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏、肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾、肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢、间脑中低度表达。本试验结果为进一步研究脂联素的功能及作用机制奠定了基础。     

表油菜素内酯对镉胁迫下番茄幼苗生长及镉累积的影响

采用盆栽试验研究不同浓度(0、0.02、0.1、0.5、2.5 mg/L)的表油菜素内酯(EBR)对镉胁迫下番茄幼苗生长及镉累积的影响。结果表明,镉处理后番茄幼苗的生物量、叶绿素含量、抗氧化酶(POD和CAT)活性均下降,丙二醛(MDA)含量、相对电导率和渗透调节物质含量均升高;喷施一定浓度的EBR(0.5 mg/L)后,番茄幼苗的生物量、叶绿素含量、抗氧化酶(POD和CAT)活性及脯氨酸含量均显著增加,可溶性蛋白、MDA含量和相对电导率有所下降,番茄幼苗根系和地上部分的镉含量分别上升了50.0%和93.4%,镉转运系数最低,为0.45。综上,喷施EBR能够增强番茄幼苗对镉胁迫的耐受性,促进幼苗生长,降低镉的转运系数,其中,EBR浓度为0.5 mg/L时效果最好。     

打顶后喷施油菜素内酯和生长素对烤烟田间生长、碳氮代谢及烟叶品质的影响

通过田间试验研究了打顶后喷施油菜素内酯(BR)和生长素(IAA)对烤烟田间生长、碳氮代谢及烟叶品质的影响。试验共设置6个处理,分别为:T1,清水;T2,10 mg?kg?1 BR;T3,10 mg?kg?1 IAA;T4,20 mg?kg?1 IAA;T5,10 mg?kg?1 IAA+10 mg?kg?1 BR;T6,20 mg?kg?1 IAA+10 mg?kg?1 BR。在打顶当天、打顶后15 d和30 d时测定烟株顶部5片烟叶的叶面积和各部位的干物质重,在打顶当天、打顶后10 d、20 d、30 d时测定烟株碳氮代谢关键酶的活性。结果表明:1)打顶后喷施油菜素内酯和生长素能不同程度地促进上部烟叶开片,促进烟株根系生长,提高上部烟叶的产量,且以二者同时喷施时效果较好;2)除对照处理外,各处理的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性均表现为先升高后降低,蔗糖转化酶和淀粉酶活性均表现为先降低后略微升高的变化趋势,说明打顶后喷施油菜素内酯和生长素能增强烟株的碳氮代谢强度,但在一定程度上推迟了烟叶成熟落黄时期,延长了生育期;3)打顶后喷施油菜素内酯和生长素可以有效提高烟叶钾含量、钾氯比、有机钾指数,并降低中、上部烟叶的烟碱和氯含量,且以对上部叶的作用效果最为明显,以二者同时施用时作用效果最好;4)处理T6(20 mg?kg?1 IAA+10 mg?kg?1 BR)促进烟株生长和提高烟叶品质的效果最佳,能使上部烟叶的钾含量、钾氯比、有机钾指数相对于对照T1分别提高40.9%、68.5%和0.524,使氯含量和烟碱分别降低16.2%和16.3%。总的来看,打顶后喷施油菜素内酯和生长素可以促进烟株生长,增强碳氮代谢,提高烟叶钾含量、钾氯比和有机钾指数,降低烟碱和氯含量,进而提高烟叶的产质量。     

外源油菜素内酯对番茄铜胁迫的缓解效应

采用营养液水培的方法,以改良毛粉802F1 番茄为材料,研究外源2,4表油菜素内酯（2,4EBR,简称EBR）对铜胁迫下番茄抗氧化酶系统及生长发育的影响。结果表明:与铜胁迫处理相比,外源EBR处理能显著激活铜胁迫下抗氧化酶系统［过氧化物酶（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）］和根系活力,使丙二醛含量明显降低,叶绿素含量和生物量显著升高;铜胁迫显著提高了番茄铜含量（尤其是根系）,而外施EBR能够显著降低铜胁迫下番茄叶片和根系铜的含量,提高带有相同电荷的竞争性离子Fe、Zn、Mn含量,利于养分平衡,维持番茄正常的生长代谢。     

天然油菜素内酯对黄土丘陵区苹果生长发育和产量的影响

在黄土丘陵区坡地台田水肥亏缺的条件下,用4种不同浓度的天然油菜素内酯(NBR)在展叶期喷施于富士苹果叶面。试验结果表明,天然油菜素内酯处理增加了叶片相对含水量和临界饱和亏,降低了自然饱和亏、需水程度、蒸腾强度、细胞膜透性和伤害率。在不同浓度的处理中,0.30mg/L的处理效果最好,与对照相比,天然油菜素内酯处理使苹果叶片相对含水量和临界饱和亏提高了11.8%和59.7%,自然饱和亏和需水程度分别降低了42.6%和52%,蒸腾强度(12:00～14:00)降低了30%左右,细胞膜透性和伤害率各降低了9.4%和37.5%。天然油菜素内酯处理减少了叶片的水分损失,提高了苹果的抗旱性。生长末期调查发现,天然油菜素内酯处理增加了苹果叶片的长度、宽度和厚度,抑制了秋梢的萌生和生长,座果率从43.4%提高到63.3%,单株产量比对照增加了8.1%～16.8%,其中0.3mg/L的处理增产效果最为明显。     

油菜素内酯对龙葵幼苗Cd毒害耐受性的影响

以重金属超富集植物龙葵为试验材料,分析了油菜素内酯(BR)对幼苗镉(Cd)毒害耐受性影响的生理机制。Cd毒害导致龙葵幼苗出现氧化伤害,同时降低了幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性。表油菜素内酯(eBL,人工合成的BR)处理增加了龙葵幼苗对Cd毒害的敏感性,与eBL处理的结果相反,施用油菜素唑(Brz,BR合成的特异性抑制剂)增加了Cd毒害下龙葵幼苗的抗氧化酶活性,降低了ROS的累积,减少了幼苗的氧化伤害。Brz处理后幼苗株高和根长较Cd处理的对照分别增加29%和28%,MDA水平和Evans blue染色程度较Cd处理的对照分别降低37%和20%,进一步证明BR增加了Cd毒害下龙葵幼苗的氧化伤害,从而加重了Cd胁迫对幼苗生长的抑制作用。表明BR通过降低龙葵幼苗的抗氧化能力,增加了幼苗对Cd毒害的敏感性。     

酵母菌6-磷酸海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达及功能验证

海藻糖是由两个葡萄糖残基经α，α-1，1糖苷键连接而成的非还原性二糖，大量实验表明，海藻糖不仅作为碳水化合物以储存能量，具有在冷冻、干燥、高渗透压等严酷环境中保护生物膜和蛋白质结构的功能，还可保护DNA免受放射引起的损伤（Yoshinaga et al．，1997）。海藻糖的这一独持性质可望用于干燥冷冻食品、药品和酶的稳定剂以及化妆品的保护剂等。     

2,4-表油菜素内酯(EBR)对网纹甜瓜光合特性和果实品质的影响

本文采用不同浓度的2,4-表油菜素内酯(EBR)处理不同发育阶段的网纹甜瓜植株,观察EBR处理植株和对照植株的光合相关指标的变化,分析收获后EBR处理和对照植株之间果实品质的差异.结果表明,提高网纹甜瓜光合速率的最有效的EBR浓度是0.1 mg·L-1.在幼苗期和初花期植株中,EBR处理改善了净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs),同时降低了胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr),而EBR对光合速率的改善是由于非气孔因素所致.在结果后期,EBR处理植株的Pn、Gs和Ci均高于对照植株,而Tr则低于对照;EBR处理植株的光合能力的上升是由于气孔因素所致.EBR可以有效地提高果实的纵径和横径,显著提高果实重量;EBR促进果实和重量增大的原因可能是EBR直接促进了细胞的生长和分裂.此外,EBR处理植株果实的可溶性固形物含量也出现显著地提高.根据上述结果推测EBR能提高网纹甜瓜植株的光合速率,促进碳水化合物从叶片向果实的转运.本研究有助于进一步探究BR类物质对甜瓜植株光合作用以及果实品质影响的作用机理,同时也为网纹甜瓜优质高产栽培提供理论依据和方法指导.     

花生防御素基因的克隆及原核表达

植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。     

表油菜素内酯对汞胁迫下小麦幼苗抗氧化系统的影响

为探讨表油菜素内酯(EBR)对小麦幼苗汞胁迫的调控作用,采用营养液水培法,研究汞胁迫下叶面喷施24-表油菜素内酯对小麦幼苗生长、叶片MDA及H2O2含量、质膜透性、抗氧化酶活性、抗氧化物质含量的影响。结果表明,50 mg·L-1汞处理小麦幼苗后,小麦幼苗的株高和干重显著降低,叶片的MDA、H2O2含量和质膜透性增加,SOD、POD和CAT活性下降,As A、GSH含量降低。与单独汞胁迫相比,叶面喷施一定浓度EBR促进了小麦幼苗的生长,降低了小麦幼苗叶片的MDA和H2O2含量,减小了质膜透性,提高了SOD、POD和CAT活性,增加了抗氧化物质As A、GSH含量,提高了As A/DHA、GSH/GSSG的比值,以EBR浓度0.01 mg·L-1为宜。综上,外源EBR可缓解汞胁迫对小麦幼苗的伤害,其机制可能与EBR能提高抗氧化酶活性及抗氧化物质含量、降低MDA和H2O2含量有关。本研究结果为降低汞污染土壤对作物生长的毒害作用提供了依据。     

茶树脱水素基因(CsDHN)的克隆及表达分析

脱水素(dehydrins,DHNs)是植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)中的一类,与低温、干旱以及盐胁迫等多种逆境反应相关.本研究采用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA ends,RACE)技术从茶树(Camellia sinensis)中获得一种茶树脱水素基因CsDHN (GenBank登录号:FJ436978),序列分析显示,该基因cDNA全长960 bp,编码201个氨基酸,推测编码蛋白质分子量约为21kD,等电点为8.3,属于Y3SK2型脱水素.CsDHN基因有2个外显子和1个内含子.生物信息学预测显示,该脱水素蛋白亲水性强、无信号肽和跨膜区,亚细胞定位于细胞质中.表达特性分析表明,CsDHN在逆境及脱落酸(abscisic acid,ABA)诱导下可上调其转录水平,4℃低温处理下表达量可提高4.2倍,而脱水处理能提高93.4倍,高盐处理能提高17.8倍,CsDHN对脱水、高盐胁迫的响应程度优于低温胁迫.CsDHN在茶树各组织器官中都有表达,其中种子中表达量最高,为叶片的11.2倍.研究表明脱水素基因CsDHN可能在茶树防御非生物逆境胁迫和参与茶树种子成熟脱水的活力保护过程起一定作用,为了解茶树抗逆分子机制提供了一定的理论基础.     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

红花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达分析

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶。为了探究SAMS在红花逆境胁迫方面的作用,本研究根据红花转录组数据从红花品种豫红花1号克隆得到1个SAMS的全长cDNA序列,命名为CtSAMS1,并对其进行生物信息学分析、组织表达特性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析。结果表明,红花CtSAMS1基因的开放阅读框(ORF)长1 173 bp,编码390个氨基酸,其蛋白分子质量为42.7 kDa,蛋白保守区预测表明CtSAMS1具有甲硫氨酸腺苷转移酶的保守结构域,属于S-腺苷甲硫氨酸合成酶家族。系统进化分析显示CtSAMS1与来自菊科的SAMS亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明,CtSAMS1基因在花和茎中表达量最高,在其他组织部位中表达量极低;CtSAMS1基因表达量随着花瓣衰老程度的增加而升高。盐、干旱和低温胁迫均能够诱导CtSAMS1基因的表达,茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸能够诱导红花花瓣中CtSAMS1基因表达,赤霉素对CtSAMS1基因表达有一定的抑制作用。本研究为进一步研究CtSAMS1在红花中的抗逆机制,以及为培育红花抗逆新品种奠定了理论基础。     

猪三十九肽胆囊收缩素(CCK39)基因的克隆和表达

以猪十二指肠中提取的总RNA为模板，根据GenBank已发表的猪三十九肽胆囊收缩素（CCK39）基因序列设计1对特异性引物。用RT-PCR扩增CCK39基因的cDNA，纯化后克隆人pUC18载体，BamHⅠ／EcoRⅠ双酶切后插入pGEX-6P-1质粒获得原核表达载体。0．5mmol／L IPTG诱导表达并纯化产物，以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备单因子血清；用抗GST抗体和自制的抗CCK39的单因子血清Westen blot检测融合蛋白。结果表明：成功地克隆出CCK39基因的cDNA，构建的原核表达载体pGEX-CCK39成功地表达约32kD的融合蛋白，抗GST抗体和抗CCK39单因子血清能识别融合蛋白，证明获得的融合蛋白具有较好的抗原性，为制备抗CCK抗体及研究CCK的各种生理功能提供大量、低廉和抗原性较强的胆囊收缩素。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。