巴西橡胶树Polyubiquitin基因5''调控序列的克隆及分析

利用GenomeWalker的方法获得了巴西橡胶树Polyubiquitin基因的5'调控序列，序列分析表明，在第一个Ubiquitin的起始密码子前含有1个内含子，内含子含有1175bp,A T含量为71.1%，另外存在TATAbox，CAATmotif,Gbox,HSE以及TCA-like等一些调控元件和1个约含230bp的A T含量丰富（90%）的区域。     

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

柚(Citrus grandis Osbeck)第一染色体的显微分离

本研究利用显微操作技术分离木本果树植物柚单个染色体，以Guan溪蜜柚的20个良好的染色体分裂相为基础，建立Guan溪蜜柚染色体核型图，并以此为依据，识别第一染色体，红显微操作，将单条是一染色体放入Eppendorf管中，为木本植物小型染色体的微切割，微分离和微克隆奠定了基础。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA（命名为HbC2）。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5＇-UTR和232bp的3＇-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。     

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

蓝粒小麦4Ag染色体的显微分离与鉴定

本研究采用显微分离技术从蓝粒小麦(Triticum aestivum L.(2n=6x=42)×Thinopyrum ponticum Liu &Wang(2n=10x=70))根尖细胞中期分裂相中分离出具有4Ag染色体形态特征的单条染色体,对分离后的细胞进行原位杂交(FISH),结果显示细胞中所剩的和显微分离到的单条染色体均为4Ag染色体.利用Sau3A接头介导的PCR方法对分离出的单条4Ag染色体进行体外扩增,扩增的DNA片段大小约为200～2 000 bp,主要集中在250～750 bp之间.以DIG-dUTP标记的蓝粒基因组DNA为探针,与该扩增产物进行Southern杂交,结果表明显微分离出的染色体得到了有效的扩增.利用该分离染色体的PCR扩增产物为探针,对蓝粒小麦进行原位杂交,证明显微分离的染色体体外扩增片段确实来源于4Ag染色体.本研究拓宽了染色体显微分离的范围,为构建4Ag染色体文库和克隆位于该染色体上的重要农艺性状基因提供了新途径.     

小麦染色体显微切割和微克隆方法的建立及HMW—GS1Dx5亚基基因克隆

在Ｃ－分带识别普通小麦钢８２－１２２染色体长臂的基础上，通过染色体显微切割和微克隆技术切割１Ｄ染色体，并通过ＰＣＲ扩增得到高分子量麦谷蛋白１Ｄｘ５亚基基因片段，序列分析证明其正确性。这一方法的建立为获得新基因特异性探针打下基础。     

一个新的巴西橡胶树胶乳UEP基因的克隆与表达分析

在成功构建乙烯利刺激条件下巴西橡胶树胶乳差异表达cDNA消减文库的基础上,我们克隆了巴西橡胶树胶乳UEP（ubiquitin extension protein）基因的cDNA全长序列。结构分析表明,该基因cDNA全长771bp,拥有一个468bp的开放阅读框架,77个核苷酸的5`UTR和226个核苷酸的3`UTR,编码156个氨基酸;Southern blot检测结果显示,UEP基因在巴西橡胶树基因组中属低拷贝基因。胶乳UEP基因的表达受到乙稀利的调节。在乙烯利处理后的24小时内,12小时收集的胶乳中UEP基因表达最强,对照和处理6小时的胶乳中表达最弱。乙烯利刺激可以促进巴西橡胶树胶乳增产和加速乳管衰老。这一结果暗示,UEP基因可能参与了乙烯利刺激巴西橡胶树胶乳增产或加速乳管衰老程的分子调控。     

巴西橡胶树K~＋通道蛋白基因HbKCO1的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR结合RACE技术,成功地克隆了一个新的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因并分析了其结构和表达特征.结果表明,该基因cDNA全长1482 bp,拥有1059 bp的开放阅读框(ORE),编码353个氨基酸残基.同源性和聚类分析证实,该基因属于植物KCO家族,命名为HbKCO1(GenBank登录号为EU827609).半定量RT-PCR分析结果显示,HbKCOl在巴西橡胶树不同器官中均有表达,但叶片中表达量最高,茎次之,根、胶乳和树皮中的表达量最低;高钾、盐胁迫(NaC1)和Ca~(2+)可以促进叶片中HbKCOl的表达,钾饥饿和ABA则起到抑制作用;胶乳中HbKCOl的表达几乎不受乙烯利(ET)和茉莉酸(JA)的影响.     

巴西橡胶树磷脂酰肌醇转移蛋白cDNA的克隆及其序列分析

本文从巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）差减cDNA文库中筛选到一个与磷脂酰肌醇转移蛋白（phos-phatidylinositol transfer protein）同源性较高的基因片段,并根据该基因片段序列信息,设计特异性引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE（rapid amplification of cDNA ends）进行差异片段的5＇和3＇端的扩增,并获得长度为1081bp的全长cDNA克隆R291（GenBank登陆号：AY589690）。序列分析表明,该基因包含702bp的开放阅读框,编码234个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为26.8kD,等电点为6.51,有一个的跨膜螺旋区（氨基酸位点为83～103）。R291基因含有一个脂质结合保守区（Sec14p-like lipid-binding domain）,具有CRAL-TRIO脂质结合结构域,推测该基因是一个磷脂酰肌醇转移蛋白基因。该基因的克隆将为橡胶树磷脂酰肌醇代谢的研究奠定了基础,将有助于进一步了解磷脂酰肌醇代谢与胶乳再生之间的关系。     

巴西橡胶树HbMCSl基因的克隆及表达分析

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶(2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphat synthase,MCS)是异戊烯基焦磷酸合成途径之一.甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate,MEP)途径中的第5个酶.催化2-磷酸-4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸.根据植物MCS的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树(Hevea brasiliensis)中获得了与其相应的MCS基因,命名为HbMCSl(GenBank登录号:FJl96164).序列分析表明HbMCSI长965 bp,编码241个氨基酸,该氨基酸序列与长春花(Catharanthus roseus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza sativa)、银杏(Ginkgo biloba)和三尖杉(Cephalotaxus fortunei)的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%.半定量RT-PCR结果显示,割胶诱导胶乳HbMCSI的表达,乙烯对HbMCSI的表达几乎没有影响;HbMCSI的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达.     

巴西橡胶树4－羟基－3－甲基－2-（E）－丁烯基－4－磷酸还原酶基因（Hb—HDR）的克隆及表达分析

4-羟基-3-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸还原酶（4-hydroxy-3-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR）是异戊烯基焦磷酸合成途径之一甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate,MEP）途径中的最后一个酶,催化4-羟基-3-甲基-（2E）-丁烯基-4-磷酸生成异戊烯基焦磷酸。根据植物HDR的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的HDR基因,命名为HbHDR。序列分析表明HbHDR长1627bp,编码462个氨基酸,属于LYTB家族,该氨基酸序列与烟草、长春花、胡黄连、拟南芥、银杏和火炬松的HDR同源性为79．1％、78．4％、76．5％、75．3％、72．2％和70．9％。半定量RT-PCR结果显示,乙烯诱导胶乳HbHDR的表达。     

巴西橡胶树HbMCS1基因的克隆及表达分析

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶（2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS）是异戊烯基焦磷酸合成途径之一——甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate,MEP）途径中的第五个酶,催化2-磷酸-4- (胞苷-5’-二磷酸)- 2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸。根据植物MCS的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的MCS基因,命名为HbMCS1。序列分析表明HbMCS1长965bp,编码241个氨基酸,该氨基酸序列与长春花、拟南芥、水稻、银杏和三尖杉的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%。半定量RT-PCR结果显示,伤害诱导胶乳HbMCS1的表达,乙烯对HbMCS1的表达几乎没有影响;HbMCS1的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达。HbMCS1的克隆和表达分析为了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和对天然橡胶生物合成的调控作用打下了基础。     

黑籽南瓜基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建及分析

黑籽南瓜(Cucurb ita ficifolia)具有很强的抗逆能力,对低温、干旱、贫瘠土壤以及瓜类枯萎病等逆境均具有较强的抗性,这些优良的抗性基因很难通过有性杂交转移到其它瓜类作物上,但可通过可转化人工染色体(TAC)以大片段的形式转化到其它瓜类作物中.本研究利用TAC载体构建了黑籽南瓜基因组DNA文库,该文库包含57 560个克隆,保存在150块384孔板中,其库容量相当于黑籽南瓜基因组的7倍.TAC文库克隆插入片段大小分布范围为20～100 kb,超过40 kb插入片段克隆占40％以上,插入片段平均大小为45kb.在挑取的15个TAC克隆中无空克隆;细菌继代培养30、60和100代后质粒的酶切鉴定表明,TAC克隆可以在大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10B中稳定复制和保存,说明本研究构建的文库质量较高.该研究结果表明,TAC文库为黑籽南瓜抗性基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等有关研究提供了基础资料.     

Pseudomonas cepacia脂酶的分子克隆

本研究从Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ染色体文库中分离到了４个酯酶基因的阳性克隆，限制性酶切分析发现脂基因位于一个３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上。脂酶基因的部分核苷酸序列进行了测定，并与已报道的酯酶基因序列作了比较分析，此外，还对不同物种的脂酶底物结合区域进行了讨论。     

猪NDUFS7基因的染色体定位、克隆和表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS7( NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein7)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的完整CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能的预测,并用半定量RT-PCR技术分析了NDUFS7基因在猪的11种组织以及在33、65和90d胚胎和成年猪骨骼肌中的相对表达水平。结果表明,将NDUFS7基因定位于猪的2号染色体2q21-q24,与标记SW395紧密连锁。该基因的CDS全长648bp,编码215个氨基酸,预测编码的产物具有一个高度保守且与能量生成有关的NouB结构域和3个激酶的磷酸化位点。同时,半定量RT-PCR结果显示,NDUFS7基因在猪的11种组织中均有表达,但表达量有差异;在65和90d胚胎骨骼肌中的表达量较高,而在33d胚胎和成年猪骨骼肌中的表达量相对较低。     

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离

由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一,水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况,本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA,构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明,克隆的外源DNA随机性良好,克隆的最小片段为27．7kb,最大为58．5kb,平均大小为39．9kb,文库克隆容量约为2．8×10^3Mb,该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针,通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析,得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在,有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量,为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。     

氮水平和形态配比对巴西橡胶树花药苗生长及氮代谢、光合作用的影响

采用砂培方法研究了不同供氮水平及NH4+/NO3-配比对巴西橡胶树花药苗生长、氮代谢及光合作用相关指标的影响。结果表明,随供氮水平的提高,橡胶花药苗茎秆、叶、地上部及单株总干重、植株各部位氮含量和氮积累量、叶绿素含量均相应升高,其中粗根、茎秆、叶片含氮量、单株吸氮量及叶绿素含量各处理间差异均达显著水平;株高、茎粗、细根干重、叶片光合速率先增后减,且以8 mmol/L氮水平时最大;低氮水平下细根硝酸还原酶（NR）活性较高。不同NH4+/NO3-配比试验中,纯NH4+营养下小苗各部位氮含量、氮积累量最高（除细根和叶柄氮积累量）;NH4+/NO3-为75/25时,小苗株高、茎粗、叶柄、叶片、植株地上部及株干重最大,NH4+/NO3-为50/50时,小苗细根干重、茎秆干重、叶绿素含量、光合速率最大,且显著大于纯NO3-营养处理;而NH4+/NO3- 50/50时,处理间差异不显著（除细根和茎秆N含量）;纯NO3-营养下小苗细根NR活性最高,但生长最弱。结果说明橡胶花药苗不适宜于纯NO3-环境,而适宜于纯NH4+及NH4+/NO3-混合营养,其适宜水平为8 mmol/L和NH4+/NO3-50/50。     

猪骨骼肌NDUFS7基因的克隆、染色体定位和表达谱分析

摘要：本研究用辐射杂种克隆板对猪的NDUFS7基因进行了染色体的物理定位，克隆了该基因的完整CDS序列，用相关软件进行了基因结构和功能的预测，并用半定量RT-PCR技术分析了NDUFS7基因在猪的11种组织以及在33天、65天、90天胚胎和成年猪的骨骼肌中的表达情况。分析结果首次将NDUFS7基因定位于猪的2号染色体２q21-q24， 与标记 SW395紧密连锁。该基因的CDS全长648bp，编码215个氨基酸，预测编码的产物具有一个高度保守的与能量生成有关的NouB结构域和３个酶的磷酸化位点。同时，RT-PCR结果显示，NDUFS7基因在猪的11种组织中均有表达，但表达量有差异；在不同发育阶段的骨骼肌中，65天和90天胚胎时的表达量较高，而33天胚胎和成年猪的表达量相对较低。     

染色体显微切割两种体外扩增方法的比较

以处一数分裂中期１的水稻三体花粉母细胞为材料,对额外染色体进行了显微分离,通过两种体外扩增方法,即接头引物ＰＣＲＩｌｉｎｋｅｒ－ａｄａｐｔｏｒ－ＰＣＲ,ＬＡ－ＰＣＲ）和简并寡聚核苷酸引物ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｐｒｉｍｅｄ－ＰＣＲ,ＤＯＰ－ＰＣＲ）,研究了这两种ＰＣＲ方法在本研究所采用的微分离染色体体外扩增中的优缺点,认为两种方法都可以有效地体外扩增,但扩增