Necrostatin-1对BCG感染后小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的调控

5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮(Necrostatin-1,Nec-1)是一种能够特异的、有效抑制细胞程序性凋亡的小分子物质.为了探讨Nec-1对卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)诱导的小鼠(Mus musculus)巨噬细胞RAW264.7凋亡的调控作用,本研究采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)比色法检测细胞存活率,Annexin V和碘化丙啶(propidine iodide,PI)双染法检测细胞凋亡率,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位水平,采用分光光度法检测细胞内Caspase-3的酶活性,qRT-PCR和Westemblot法检测凋亡相关基因的mRNA和蛋白表达水平.结果表明,Nec-1可提高被BCG感染巨噬细胞的存活率,降低其凋亡率,通过降低线粒体膜电位水平、上调抑凋亡基因Bcl-2的表达同时下调RIP1、RIP3和BAX基因的表达水平,从而有效降低了Caspase-3的蛋白表达量及酶活性.本研究表明Nec-1可通过提高线粒体膜电位水平、并下调促凋亡蛋白的表达量,从而抑制被BCG感染后巨噬细胞的凋亡,这将有助于进一步研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)与巨噬细胞间的相互作用,对于揭示结核病的致病机理具有重要意义.     

不同卡介苗(BCG)免疫剂量和接种的小鼠日龄对牛羊结核病的免疫保护和IFN-γ/ IL-4表达的影响

选用BalB/C乳鼠和成年BalB/C小鼠进行卡介苗（bacillus calmette-guerin, BCG）接种, 攻毒后用体外培养法观察脾细胞内病原生长特性以及用enzyme-linked immunospot (ELISPOT)方法检测脾细胞诱导表达γ-干扰素（interferon -γ,IFN-γ）和白细胞介素-4（interleukin -4,IL-4）的变化。结果显示,低剂量（2×103 cfu）BCG对7日龄乳鼠可产生100%的免疫保护,高剂量（4×104 cfu）BCG产生75%的免疫保护;而低剂量（2×103 cfu）BCG对35日龄小鼠产生的免疫保护为67%。低剂量（2×103 cfu）BCG诱导乳鼠产生以IFN-γ为主的Th1类细胞免疫反应明显增强,以IL-4为主的Th2类免疫反应降低;而高剂量（4×104 cfu ）BCG诱导产生的IFN-γ/IL-4均增多。低剂量（2×103 cfu）BCG接种诱导35日龄小鼠产生的IFN-γ/IL-4亦均增多。结果表明,卡介苗BCG对小鼠的保护率与BCG免疫剂量和免疫动物日龄间存在紧密的相关性,这种差异可能与BCG诱导产生的Th1/Th2类细胞免疫反应的变化有关。     

结核分枝杆菌(H37Rv和BCG)在感染AECⅡ细胞系A549中对TLRs信号通路和促炎因子表达的影响

肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcells,AECⅡ)是由呼吸道吸入的结核病原菌最先侵染的靶细胞.本研究通过建立结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)强毒株(H37Rv)、弱毒株(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染AECⅡ细胞模型,分析不同感染时间Toll样受体(toll-liking receptors,TLRs)信号通路活化和炎症细胞因子分泌的差异,探讨AECⅡ细胞在Mtb感染时的免疫应答和持续感染的分子机制.利用H37Rv和BCG分别感染AECⅡ细胞系A549,通过荧光定量PCR和Western-blot等技术在核酸和蛋白水平分析感染6、12和24h时TLRs信号通路信号分子和促炎细胞因子的表达变化.结果表明,mRNA表达水平检测发现,在H37Rv感染A549细胞中,TLR2、TLR4、MyD88和NFκB在6h时显著高于BCG感染组;在感染24h时,两组TLR2、TLR4表达均上调,且差异不显著,而H37Rv感染组NFκB呈上调表达;在蛋白水平分析发现,在H37Rv感染引起A549细胞中MyD88和磷酸化NFκB表达呈显著下调趋势,且高于BCG感染组;而促炎细胞因子IL-1a、IL-6、IL-12a、IL-8、TNF-α和CSF2 mRNA表达水平随着感染时间升高,且H37Rv感染组IL-1a、IL-6 1L-8、TNF-α、和CSF2的表达显著高于BCG感染组,IL-12a差异不显著.本研究发现,Mtb强毒株感染AECⅡ细胞对TLRs信号通路表现为抑制趋势,且引起细胞的炎症反应明显强于弱毒株,这为阐明AECⅡ细胞在不同毒力结核分枝杆菌感染中的免疫调控机制研究和临床肺结核的发病机制研究提供了参考依据.     

鲨烯环氧酶基因(SQEs)的克隆及其在温度胁迫下与枇杷悬浮培养细胞中熊果酸(UA)含量的相关性

熊果酸(ursolic acid,UA)是枇杷(Eriobotrya japonica L.)中重要的生物活性成份,鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQE)是UA等五环三帖生物合成途径中的限速酶之一。为了克隆SQEs基因,寻找枇杷细胞悬浮培养获取UA合适的胁迫温度,建立此胁迫温度下SQEs的差异表达及其与UA含量的联系,本研究以枇杷悬浮培养细胞为材料,在对数生长期中后期设置低温15℃和高温35℃处理,研究收获时(12 d)细胞生长与目标产物UA的相互关系。同时,采用同源克隆方法分离SQEs,研究15℃处理中,两个枇杷鲨烯环氧酶基因(ej SQE1和ej SQE2)的差异性表达。结果表明,ej SQE1(Gen Bank登录号:JQ294053.2)与ej SQE2(Gen Bank登录号:JQ294054.2)氨基酸序列的相似度为69.89%,序列的两末端差异最大;15℃下,距离收获48 h的处理中UA总含量最高;ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。15℃下,距离收获24 h的处理,两者表达量显著下降(P<0.05);距离收获长于24 h的处理,枇杷悬浮细胞中ej SQE1和ej SQE2两个基因的表达量之和以及ej SQE2基因与UA的含量呈现出显著正相关(P<0.05)。本研究获得了SQEs基因序列及胁迫温度下的表达特征,为枇杷细胞悬浮培养UA调控机制的研究提供基因源及参考资料。     

F18菌毛粘附素F基因(fedF)在大肠杆菌中的表达及对小鼠的免疫保护效果

引起早期仔猪断奶腹泻(PWED)的主要致病菌是产肠毒素型大肠杆菌(ETEC),免疫预防是防治腹泻最主要的手段。本研究采用通过大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组F18菌毛粘附素F(FedF)作为抗原,在小鼠(Mus musculus)中探索以此为靶标免疫防治仔猪腹泻的可能性。根据相应F18菌毛粘附素基因(fedF)设计了一对添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以E.coli F18为模板扩增出全长908bp含20个信号肽序列的fedF片段,并与原核表达载体pET-30a(+)连接,导入大肠杆菌BL21,得到基因工程菌E.coli[pET-fedF],后经IPTG诱导及菌液蛋白电泳分析,结果表明,大小约为32.9kD的重组蛋白FedF可成功诱导表达;将重组工程菌口服免疫BALB/c小鼠,可有效地诱导小鼠血清中FedF特异性IgG的产生(P/N值>2.0)及小鼠肠粘膜sIgA显著增加了2.07倍(与空载体组pET-30比较)(P<0.05);攻毒试验表明,口服基因工程菌E.coli[pET-fedF]可显著地有效保护小鼠免予攻毒死亡,免疫保护率可达62.5%。研究结果提示,FedF黏附蛋白基因工程菌可通过口服诱导小鼠特异的体液和粘膜免疫反应,以此保护小鼠免受产肠毒素型大肠杆菌的进攻,因而有望作为一种口服疫苗防治产肠毒素型大肠杆菌引起的仔猪腹泻。