鹅myf6基因的克隆,胚胎期以及填饲后表达特征分析

myf6基因属于MyoD家族成员之一,为成肌细胞分化成肌管的重要调控因子。本研究旨在克隆鹅(Anser anser)myf6基因,并进一步探讨该基因的结构与功能,揭示其在胚胎期和填饲后的表达特征。以鹅肌肉总RNA为模板,采用RACE的方法,克隆该基因全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。运用实时荧光定量PCR检测myf6基因在鹅不同胚胎期mRNA的表达规律,以及填饲对其表达的影响。鹅myf6全长cDNA为1 196 bp,包括90 bp的5'UTR,383 bp的3'UTR和723 bp的开放阅读框(ORF),共编码240个氨基酸(GenBank登录号:JQ905627)。经预测鹅myf6编码蛋白的分子量为26 214.4,等电点为5.68,平均亲水性为-0.595,为不稳定亲水蛋白。预测鹅myf6蛋白具有Basic和HLH这两个明显的结构域,bHLH蛋白结构域形成剪刀状α-螺旋二聚体,且不同物种间HLH氨基酸序列高度同源。鹅myf6基因CDS区序列与鸭(Anas platyrhynchos)同源性最高,为98.62%,与哺乳类同源性在81%左右,与鱼类同源性较低,仅62%～66%。构建的系统进化树显示,所有哺乳类、鸟类、硬骨鱼各形成一个大的分支,两栖类形成独立分支,鹅首先与绿头鸭(Anas platyrhynchos)聚成一支,分子进化地位上关系最近,其次聚类顺序较近的物种为红原鸡(Gallus gallus),该结果与这些物种在生物学上的分类是较一致的。荧光定量PCR结果显示,鹅myf6 mRNA在胚胎早期第7天就有少量的表达,7天以后表达量逐渐上升,随后在胚胎中期表达量明显升高;其在E18肌肉组织中表达量达到高峰后下降,胚胎发育后期E21 myf6 mRNA的表达量是E25的近4倍,E25后逐渐趋于平稳;E18与E14、E15、E25和E28的表达差异极显著(P0.01),E21与E25、E28的表达也差异极显著(P0.01),与E14、E15的表达差异显著(P0.05)。在鹅的胸肌和腿肌组织中,填饲组myf6 mRNA表达量高于对照组中该基因的表达量,且胸肌组织达到显著水平(P0.05)。鹅myf6基因的表达具有组织特异性,该结果为进一步研究生肌调节因子myf6基因结构及其在鹅胚胎期肌肉发育中的作用提供了理论基础。     

SYBR Green I荧光定量PCR法检测朗德鹅填饲前后黑素皮质素受体-4基因(MC4R)的表达

黑素皮质素受体4基因(MC4R)在各组织中的不同表达对于鹅脂肪代谢具有重要作用.本研究应用强制填饲技术建立腹型肥胖朗德鹅(Casuarius casuarius)模型,提取填饲后及正常朗德鹅新鲜腹脂、肝脏等13种组织的总RNA,SYBR GreenI荧光定量PCR法检测各组织MC4R基因的表达,选择β-actin作为内参基因,使用半定量2-△△Ct法分析.PCR结果显示,MC4R基因及β-actin在填饲前后朗德鹅心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌胃、小肠、胰腺、脑、胸肌、腿肌、腹脂、皮下脂等13种组织中均存在不同程度表达.SYBR Green I荧光定量PCR结果表明,在肾、小肠和心这3个组织中,填饲后朗德鹅MC4R表达量均比对照组中朗德鹅该基因表达量低,填饲后分别为填饲前表达量的0.41±1.80、0.65±5.75和0.72±1.22倍.而在其他组织中,MC4R基因表达量均有不同程度的增加,填饲组/对照组相对表达量倍数由高到低顺序分别为:22.78±1.00倍(脑),9.08±2.80倍(肝),5.28±1.83倍(肺),3.78±3.01倍(胰),3.07±3.64倍(腿肌),2.90±0.97倍(胃),2.34±1.66倍(皮下脂肪),2.18±3.01倍(腹脂),2.07±0.37倍(胸肌),2.01±1.75倍(脾).结果符合MC4R作用机理,为畜牧生产及人类肥胖问题的研究提供间接依据.     

朗德鹅肝脏、脂肪组织LXRα基因表达水平的比较研究

本文采用荧光定量PCR技术检测了填饲、未填饲朗德鹅肝脏、腹脂、皮下脂肪组织和肌肉LXRα基因mRNA的表达水平,并与谷丙转氨酶等6种血清生化指标进行了相关性分析,结果发现：填饲组肝脏、腹脂组织LXRα基因mRNA表达水平显著高于对照组（P<0.05）,高肝组皮下脂肪组织LXRα基因mRNA表达水平显著高于对照组、低肝组（P<0.05）;肝脏组织LXRα基因mRNA表达水平与肝重/体重比呈显著正相关（P<0.05）,相关系数为0.58,皮下脂肪组织LXRα基因mRNA表达水平与肝重/体重比呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数为0.77;肝脏LXRα基因mRNA表达水平与血清中甘油三酯、胆碱脂酶含量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数分别是0.66和0.70。     

朗德鹅肝脏和脂肪组织LXRα基因表达水平的比较

采用荧光定量PCR技术检测了填饲和未填饲朗德鹅(landes anser)肝脏、腹脂、皮下脂肪组织和肌肉肝X受体α(LXRα)mRNA的表达水平,并与谷丙转氨酶等6种血清生化指标进行了相关性分析.结果发现,填饲组肝脏和腹脂组织LXRαmRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),高肝组皮下脂肪组织LXRα mRNA表达水平显著高于对照组和低肝组(P<0.05);肝脏组织LXRαmRNA表达水平与肝重/体重比呈显著正相关(P<0.05),相关系数为0.58,皮下脂肪组织LXRαmRNA表达水平与肝重/体重比呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.77;肝脏LXRαmRNA表达水平与血清中甘油三酯和胆碱脂酶含量呈极显著正相关(P<0.01),相关系数分别是0.66和0.70.     

高邮鸭TNNI1基因克隆及组织表达分析

慢速骨骼肌型肌钙蛋白(slow skeletal muscle troponin I 1,ss TNI,TNNI1)基因主要定位于慢收缩骨骼肌肌纤维,在肌肉发育中具有重要的作用。本研究旨在克隆高邮鸭(Anas platyrhynchos)TNNI1基因并分析其在不同组织中的表达规律。以高邮鸭为实验材料,利用5′和3′cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA ends,RACE)技术,克隆TNNI1基因全长cDNA序列并进行同源性分析;利用荧光定量PCR技术,检测TNNI1基因在70日龄高邮鸭不同组织中的表达差异和不同发育阶段肌肉组织中的表达规律。结果表明,TNNI1基因全长cDNA序列为965 bp,包括56 bp的5′UTR,345 bp的3′UTR和564 bp的ORF,编码187个氨基酸(Gen Bank登录号:KY926794)。序列同源性分析发现,与北京鸭、鹌鹑(Coturnix japonica)、鸡(Gallus gallus)和哺乳动物TNNI1基因的同源性分别为97.9%、97.9%、97.3%和87.7%。系统进化树分析表明,高邮鸭与鹌鹑和鸡的亲缘关系最近,与哺乳动物亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,TNNI1基因在本实验各个组织中均有表达,其中腿肌表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01);其次是心脏、肺、胸肌、腺胃、肾脏和十二指肠组织;而大脑、肝脏、脾脏和下丘脑中表达量最低。21胚龄胸肌TNNI1基因表达量极显著高于腿肌(P0.01),其他发育阶段均是腿肌表达量显著高于胸肌(P0.05)。高邮鸭TNNI1基因结构与组织表达特征的研究结果,为进一步研究TNNI1基因在鸭肌肉发育中的作用机制提供了基础资料。     

填饲对朗德鹅SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化和mRNA表达的影响

DNA甲基化是表观遗传学的研究热点之一.为了探索填饲是否能够引起朗德鹅Anser anser)肝脏脂类代谢中DNA甲基化水平以及基因表达量的变化和DNA甲基化修饰作用和基因表达之间的关系.本研究运用焦磷酸测序技术分析鹅肝脏硬脂酞辅酶A去饱和酶5基因(stearovl-CoA desaturase 5,SCD5)、固醇调节元件结合蛋白2基因(sterol regulatory element-binding protein 2,SREBP2)和超长链脂肪酸延伸酶6基因(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)的甲基化水平,再运用qRT-PCR技术进行定量验证.结果显示,SCD5、SREBP2和ELOVL6各2个片段的甲基化水平均在20％以上,均属于高甲基化状态;对照组3个基因各2个片段的甲基化水平均高于填饲组,填饲组与对照组的SCD5-1S和SREBP2-1S片段甲基化差异显著(P＜0.05),SREBP2-2S片段甲基化差异极显著(P＜0.01),SCD5-2S、ELOVL6-1S和ELOLV6-2S片段甲基化差异不显著(P＞0.05);填饲组SCD5和ELOVL6的mRNA表达量均高于对照组,而SREBP2在填饲组的mRNA表达量显著低于对照组(P＜0.05).综合各项指标,填饲引起鹅肝脏组织SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化水平降低,SCD5和ELOVL6 mRNA表达量上升,SREBP2的mRNA表达量降低,表明SCD5和ELOVL6的甲基化修饰对mRNA的表达起反向调控的作用.本实验结果为表观遗传学上DNA甲基化研究方法提供参考,为选育鹅肥肝高产高质系提供重要的分子遗传学依据,也为人类肥胖症和脂肪肝等代谢疾病的研究提供理论依据.     

鹅肌球蛋白重链1基因MyHC1全长cDNA克隆、序列及胚胎期表达特征分析

肌球蛋白是组成肌原纤维粗丝的主要成分,在肌肉生长发育和运动收缩过程起重要作用。本研究采用反转录PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA ends,RACE)方法,从太湖鹅(Anser anser)肌肉中克隆到肌球蛋白重链1基因(myosin heavy chain 1,MyHC1)的全长cDNA,并运用生物信息学的方法对其进行分析,实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测MyHC1基因在鹅胚胎期的表达情况。研究结果表明,鹅MyHC1基因(Gen Bank登录号:KM675469)cDNA全长6028 bp,包含5 823 bp的开放性阅读框,57 bp的5’端非编码区和148 bp的3’端非编码区,共编码1 940个氨基酸。经预测,鹅MyHC1基因编码的蛋白质由31 478个原子组成,分子式为C9746H15817N2753O3096S66,相对分子质量为223 kD,等电点为5.62,平均亲水性为-0.786,属于不稳定亲水蛋白。在线预测鹅和鸡(Gallus gallus)的MyHC1蛋白质三维结构呈高度相似,由多螺旋和折叠片聚集成球状头部,并带有长纤维状α-螺旋尾部。鹅MyHC1的编码区(coding sequence,CDS)序列与鸡的同源性最高,为92.86%,与哺乳类同源性多数在84%左右,与两栖类同源性相对较低。鹅与鸡氨基酸同源性最高,为96.45%,与哺乳类的同源性多数在90%左右,与非洲爪蛙(Xenopus laevis)同源性较低,为78.13%。系统进化树分析表明,哺乳动物形成一个大分支,两栖类自成一支,鹅和红原鸡聚成一支,分子进化地位的关系最近,验证了鹅和鸡属于近缘物种。qRT-PCR检测到MyHC1基因在胚胎期第7天开始表达,以后表达量逐渐升高,在15d表达量达到高峰后下降,25d之后逐渐趋于平稳,表明,MyHC1基因在鹅胚胎期mRNA水平的表达量呈先上升再下降的趋势。本研究首次获得了鹅MyHC1的全长cDNA序列、分子的结构特点和表达特征,显示该基因在鹅肌肉生长发育过程起重要作用,为该基因的功能及鹅肉质性状研究提供了基础资料。     

天祝白牦牛金属硫蛋白基因(MT-1)全序列分子克隆及生物信息学分析

金属硫蛋白-1基因(metallothionein-1,MT-1)是一类广泛存在于动物体内的金属结合蛋白,除维持金属动态平衡和重金属解毒外,还可参与清除自由基、拮抗电离辐射和抗应激等。为深入研究MT-1基因参与动物机体抗逆性的分子机制,本研究采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛(Bos grunneins)MT-1基因全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析MT-1蛋白的理化性质、结构和不同物种间的同源性,并利用RT-qPCR方法分析MT-1基因在天祝白牦牛各个脏器和组织中的表达丰度。结果表明,天祝白牦牛MT-1基因cDNA序列全长为408 bp(GenBank登录号:KF770836),开放阅读框(ORF)长186 bp,编码61个氨基酸,氨基酸的分子量为5.981 kD;氨基酸序列分析显示,天祝白牦牛MT-1基因编码氨基酸序列与牛(Bos taurus)的同源性高达100%,同时与大多数哺乳动物相似;荧光定量PCR结果发现,MT-1 mRNA在天祝白牦牛8个不同脏器和组织中均有表达,心脏中表达量最高。天祝白牦牛MT-1基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能提供了基础资料。     

一个在超饲养朗德鹅肝脏中差异表达基因的分离和鉴定

为阐明鹅（Anser anser）肥肝形成的机制,使用mRNA差异显示技术研究超饲养和正常饲养条件下朗德鹅肝脏基因表达差异。基因转化生长因子β2(TGFB2)被证实在肥肝中上调（P < 0.01）,该基因1 248 bp的cds序列(GenBank 登陆号EF541127)与鸡TGFB2有94%的同源性。序列分析表明,该序列含有一个1 239 bp的开放读码框架（ORF）,编码412个氨基酸的蛋白质,该蛋白质序列存在2个保守的功能域：引导序列（TGFb前肽）和功能结构域（TGFβ）,并与其它同源蛋白有较高的同源性。应用生物信息学方法对该蛋白质的功能和结构进行了分析。组织表达分析表明,鹅TGFB2在肝、肌胃、脾和卵巢中表达丰富,在子宫、肺和肌肉中中等表达,在肾和腹脂中表达量较低。结果显示,超饲养诱导了鹅肝脏TGFB2基因mRNA表达水平的上调。     

黑番鸭血管活性肠肽受体-1基因(VIPR-1)的cDNA克隆及其组织表达特性分析

最近的研究表明,血管活性肠肽(VIP)与家禽的就巢习性密切相关。本研究采用反转录PCR方法从黒番鸭(Cairina moschata)母鸭下丘脑组织中克隆了血管活性肠肽受体(VIPR-1)基因的cDNA序列,长度为1125bp,编码355个氨基酸(GenBank登录号:JN625215)。序列比对结果表明,该序列与家禽(鸡、火鸡、鹌鹑)和哺乳动物(人、小鼠、猪、牛)的基因序列分别有93%~94%和69%~71%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性分别为96%和70%~72%。荧光定量PCR结果发现,黒番鸭VIPR-1基因的表达量在产蛋期、就巢期和休产期差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),就巢期表达量最高,休产期次之,产蛋期表达量最低,表明VIPR-1基因与繁殖阶段变化密切相关;对不同组织VIPR-1的表达量分析发现,VIPR-1在垂体、下丘脑和卵巢中均有表达,其中垂体最多,其次是下丘脑,卵巢中的表达量最低,差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,VIPR-1基因具有高度保守性,参与下丘脑-垂体-卵巢轴(特别是垂体)对黑番鸭就巢行为的调控。     

中华绒螯蟹Na~+/K~+-ATPase α1基因的分子克隆与表达分析

Na+/K+-ATPase是水产动物体内渗透压调节的关键酶。本研究通过RT-PCR和RACE技术首次从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)中克隆了Na+/K+-ATPaseα1基因(GenBank登录号:KC691291.1);该基因的全长cDNA为3 805 bp,包含306 bp的5'-UTR、3 111 bp的开放阅读框(编码1 037个氨基酸)和388 bp的3'-UTR。氨基酸序列与其它水生甲壳动物的同源性高达91.9%~98.5%,表明其在甲壳动物间有高度的保守性。荧光定量PCR检测结果表明,该基因在肝胰腺中的表达量最高,鳃中的表达量次之,肠和胃中的表达量较为接近,肌肉和心脏中的表达量最低;该基因在中华绒螯蟹的8个发育阶段均有表达,在溞状幼体期(溞I~溞Ⅴ)的表达量均较低,大眼幼体期的表达量最高,而后表达量下降,仔蟹期的表达量显著高于幼蟹期(P0.05);通过对海水(盐度21)和淡水中饲养30 d的成蟹组织表达检测,海水环境中该基因在肌肉和肝胰腺的表达水平显著高于淡水环境(P0.05),而淡水环境中该基因在鳃中的表达水平却显著高于海水环境(P0.05),海水和淡水环境中该基因在性腺组织中的表达水平不存在显著差异(P0.05)。本研究结果表明,肝胰腺和鳃是中华绒螯蟹Na+/K+-ATPaseα1基因的主要表达器官,Na+/K+-ATPaseα1对中华绒螯蟹渗透压调节起重要作用。本研究结果为生产上的蟹苗培育和亲体保育的适宜盐度控制提供了理论依据。     

猪MYL4基因的克隆及其在猪胚胎骨骼肌中的表达分析

克隆了猪(Sus scrota)MYL4基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行验证.所得cDNA序列全长1105 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码197个氨基酸.序列分析表明,该基因与已报道的狗(Canis lupus familiaris)、人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)和恒河猴(Macaca mulatta)等物种的MYL4基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为98.4%、95.9%、95.4%和95.4%.该基因编码的蛋白具有EFH和FRQ1保守功能域.荧光定量分析该基因在猪胚胎骨骼肌(妊娠33、65和90d)中的表达,发现MYL4基因在通城猪和长白猪中呈波浪式表达模式,在妊娠第33天时中外猪品种间无显著差异,但在第65和90天时长白猪中显著高于通城猪.     

半滑舌鳎甲状腺激素受体β基因(TRβ)的克隆与表达分析

甲状腺激素在鲽形目仔鱼的变态过程中起着重要的作用,而甲状腺激素的生物效应是由甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors,TRs)介导的。本研究利用RACE技术克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TRβ基因的全长,并对其功能进行了生物信息学分析。结果显示,TRβ基因(GenBank登录号:No.KJ499433)cDNA全长为2 345 bp,开放读框(open reading frame,ORF)长1 188 bp,编码396个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR分别长454和703 bp。通过氨基酸序列比对发现,TRβ氨基酸序列铰链区有一段由9个氨基酸残基组成的插入序列,推测这段序列可能为硬骨鱼类TRβ基因所特有的。实时荧光定量PCR技术分析结果显示,TRβ基因在各组织中均有表达,且在肝组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05);因此推测TRβ基因在半滑舌鳎成鱼各组织中具有多样性的功能,而且其在肝脏的新陈代谢中起到重要的调节作用。在半滑舌鳎仔鱼变态时,TRβ基因的表达量随变态开始而迅速增加,在变态高峰期到达最高。药物处理实验结果显示,正常变态和提前变态的仔鱼TRβ基因的表达水平均随变态开始而迅速上调,而变态被抑制的仔鱼中TRβ基因的表达量则未出现显著变化,表明TRβ是调控半滑舌鳎仔鱼变态过程的重要基因,在半滑舌鳎生长发育早期阶段起较关键作用。本研究为深入解析半滑舌鳎变态的分子机制提供了理论依据和参考。     

绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA的克隆、表达及其结构模拟分析

为探讨绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)在不同生长阶段背最长肌中的表达特性,本实验以成年小尾寒羊(Ovis aries)皮下脂肪组织总RNA为实验材料,在脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA保守区域设计1对引物Ff和Fr,采用RT-PCR方法克隆了绵羊FABP4全编码序列,并运用生物软件对FABP4蛋白空间结构进行分析.同时运用实时荧光定量PCR法,对FABP4在皮下脂肪和背最长肌中的表达以及不同日龄在背最长肌中的表达量与背最长肌肌内脂肪含量的相关性进行了初步研究.结果表明:绵羊FABP4基因cDNA长度为464bp,包含1个由399 bp组成的开放阅读框,编码132个氨基酸.生物信息学分析表明,不同物种间FABP4氨基酸序列具有较强的保守性,蛋白质空间结构呈2个α螺旋和10个β折叠围绕的桶状构型.实时荧光定量PCR试验表明,FABP4基因在160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量明显高于90日龄背最长肌的表达量(P＜0.05);且在90、120、160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量与相应日龄的背最长肌肌内脂肪含量呈正相关(R2=0.7196,P＜0.01).本研究结果表明,调控FABP4基因在背最长肌的表达是改善绵羊肉质的潜在途径.     

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。     

重瓣山茶红十八学士花发育B功能基因CjDEF-1的分离与表达分析

为研究B功能基因在山茶重瓣花形成中作用,用同源克隆的方法从红十八学士(Camellia japonica Hongshibaxueshi)花芽cDNA中克隆到DEFICIENS(DEF)基因同源序列片段,用RACE(rapid amplification of cDNA end)技术获得该基因cDNA全长,命名为 CjDEF-1(GenBank登录号为HM773024.1).通过氨基酸序列比对分析了一些单瓣、重瓣植物DEF同源基因差别,并采用Real-time PCR技术研究CiDEF-1基因在红十八学士中的时、空表达特点.结果显示,红十八学士CiDEF-1基因cDNA全长1 013bp,包含一个完整开放阅读框,编码226个氨基酸.序列分析表明,红十八学士与近缘雪山茶(Camellia japonica subsp.rusticana)至少有4个编码氨基酸不同.在红十八学士不同发育时期中,GiDEF-1基因在小花苞表达量最高,中等花苞表达量最低,在开花期表达量又升高;在花不同组织中的表达情况从高到低排列为:中心花瓣＞外轮花瓣＞中间花瓣＞萼片＞苞片,这与同源GiDEF基因在单瓣雪山茶中表达情况不同.从这些研究的差异表明,GiDEF-1基因可能在山茶重瓣花形成中起作用.     

粉菠萝FVE同源基因的克隆及表达分析

FWE是植物自主开花途径中的关键基因,主要通过抑制FLC的表达来调控花发育过程。本研究利用粉菠萝似echmeafasciata）茎尖组织转录组序列数据,通过RACE技术克隆获得了粉菠萝中n,E同源基因A毋yE的cDNA全长序列。该序列全长为1672bp,开放阅读框为1404bp,编码由468个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列中含有6个保守的WD重复区域。氨基酸序列比对结果表明,4椰E基因编码的氨基酸序列与其它物种中WE的同源序列具有较高的相似性。qRT—PCR（实时荧光定量PCR）分析结果显示,粉菠萝中A椰E基因对外源乙烯的刺激产生了应答。在采用乙烯利灌心处理不同时间的过程中,发现A删E基因的转录水平均在处理后1d时达到最大,推测A椰E可能参与乙烯信号反应,该基因在粉菠萝自主开花途径中的调节作用可能受乙烯影响。     

绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)cDNA克隆与组织表达分析

热休克蛋白(HSP)与生物机体的耐热性能相关。为研究不同热应激模式下与热应激恢复过程绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)mRNA在不同组织中表达差异,阐明HSP90基因的热应激保护的分子机理。本研究采用RT-PCR方法从绍兴鸭(Anas platyrhynchos)肝脏组织中克隆HSP90 cDNA序列(GenBank登陆号:JQ837244),编码区序列长度为2211bp,编码736个氨基酸;氨基酸序列比对结果显示,绍兴鸭与家禽(北京鸭、火鸡、鸡、日本鹌鹑)和哺乳动物(大猩猩、人、牛、灰狼等)的基因序列分别有92.6%～99%和80%～88%的同源性;荧光定量PCR结果发现,30℃长期应激能显著提高绍兴鸭垂体中HSP90 mRNA表达量;35℃长期应激能显著提高心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平;40℃急性热应激时,心脏、肝脏、肾脏、垂体和胰腺中的HSP90 mRNA表达量达到最高值。恢复性实验表明,热应激恢复1h肝脏和心脏中HSP90 mRNA表达水平最高,均于3h降低到应激前水平。心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平与热应激强度显著相关。本研究为以HSP90 mRNA表达水平为衡量指标进行绍兴鸭热应激预防与控制提供资料。     

鸡肝脏中PNPLA3基因表达及调控研究

PNPLA3(patatin like phospholipase domain-containing 3)也称为脂肪细胞营养素(adiponutrin)或不依赖于钙的磷脂酶A2ε(calcium-independent phospholipase A2ε,i PLA2ε),是PNPLAs家族中的一员,具有水解磷脂和中性脂质的活性以及酯酰基转移酶活性,能够参与脂肪的积累和脂肪动员。本研究旨在探讨鸡(Gallus gallus)肝脏中PNPLA3基因表达调控规律,为进一步阐明PNPLA3基因在鸡肝脏脂质代谢中的生物学功能奠定基础。首先运用生物信息学方法对鸡和其他12种动物的PNPLA3氨基酸序列进行分子进化分析;然后利用q RT-PCR技术,分析PNPLA3基因在不同发育时期卢氏绿壳蛋鸡各组织的时空表达规律,并分别从个体与细胞水平分析雌激素及其受体拮抗剂对PNPLA3表达的调控机制。结果表明,鸡与两栖类、爬行类和鱼类等物种的PNPLA3氨基酸序列相似性较高,在哺乳动物人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种中的序列相似性较低;鸡PNPLA3基因在各组织中表现出广泛表达的特性,其中在10周龄的鸡胸肌、腹脂、胰腺中表达水平较高,在30周龄鸡的肝脏、胸肌、腹脂中表达水平较高,且在肝脏中的表达水平随着性成熟而显著升高(P0.01);雌激素处理可显著提高鸡肝脏组织和体外培养的鸡胚胎肝原代细胞中PNPLA3的表达水平(P0.05),雌激素受体(estrogen receptor,ER)-α特异性拮抗剂MPP(methyl-piperidino-pyrazole)可完全抑制雌激素的作用(P0.05)。综上所述,鸡与两栖类和鱼类等物种的PNPLA3氨基酸序列相似性较高,与哺乳动物序列相似性较低;PNPLA3在肝脏组织表达丰度较高,且在性成熟后显著升高;雌激素通过雌激素受体ER-α调控PNPLA3表达。上述发现为深入研究鸡PNPLA3与肝脏脂肪代谢调控机制提供了基础资料。     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...