梅岭土鸡原始生殖细胞的生物学特性

作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞,由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型,而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs,接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养;借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)、SSEA-1(胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT(端粒酶反转录酶)进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh(鸡死端同系物)、Dazl(类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ(POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog同源异型盒)、Sox-2(性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析;利用脂质体介导法,将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞,结果表明,PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性;PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达;转染24h后,绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核,转染效率最高为16%,研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞研究

提取第28 期鸡胚性腺中的原始生殖细胞(PGCs)，将其与性腺基质细胞共培养，并对PGCs 进行PAS (过碘酸希夫试剂) 和AKP(碱性磷酸酶) 染色鉴定。构建pLenti-CMV-eGFP 慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT 细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19 %。实验还比较了慢病毒不同剂量对转染效率的影响，随着慢病毒剂量的增加，转染效率显著提高。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。     

Sleeping Beauty (SB)转座子介导增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)体内转染鸡胚胎

为了探索转座子介导技术在鸡胚中的转染效果,本研究采用鸡蛋开窗法将Sleeping Beauty (SB)单质粒转座载体pT2-SV40-EGFP-SB11注射至孵化36 h鸡(Gallus domes ticus)胚盘中,同时设开窗不注射组和不开窗组.利用体视荧光显微镜和RT-PCR方法检测增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达率,并比较不同阶段的胚胎成活率、孵化率以及蛋重变化.结果表明,EGFP在鸡胚胎中获得较高的表达率(40％～89％);开窗组和不开窗组在胚胎发育早期蛋重变化差异不显著(P＞0.05),而后期开窗注射组的蛋重比例显著低于不开窗组(P＜0.05);三组胚胎的成活率和孵化率在整个发育过程中变化显著(P＜0.05).本实验初步证明了经改良的鸡蛋开窗法可用于鸡胚转基因研究,并初步建立了SB转座子介导外源基因在鸡胚中转染方法.     

利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达

本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73％、52％和85％;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台.     

鸡FGF8基因RNA干扰载体的构建及其对PGCs形成的影响

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要。为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus)FGF8的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能。根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到p GMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1。以q RT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的sh RNA载体进行慢病毒包装。在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用q RT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率。结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为sh FGF8-1、sh FGF8-2、sh FGF8-3,其中sh FGF8-2干扰效率最佳。将sh FGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×10~(8 )TU/m L、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体。对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4 d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P0.01),PGC标记基因Cvh、C-kit表达极显著上调(P0.01)。此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4 d后与对照组比较,FGF8低表达使CVH~+PGCs比例显著增加(P0.01)。本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参与调控PGCs的形成。     

用PCR法检测性反转母鸡W精子的产生

在自然界公鸡和母鸡的性别分别由性染色体ＺＺ和ＺＷ所决定。因此公产生的精子其性染色体均是Ｚ,而母鸡产生的卵子有Ｚ和Ｗ两种。本实验在受精卵孵化的第三天注入芳香化酶抑制剂以抑制雌激素的合成,用Ｗ染色体特异的基因鉴别性别后将雌鸡饲养性成熟。这些性反转母鸡有与公鸡相似的表型和雄性交配行为,但无精子排出,为了观察性腺内是否有精子产生,取出睾丸在显微镜下捕获单个精子,用Ｗ染色体基因特异的寡核苷酸引物进行了ＰＣＲ     

精原干细胞的研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）指位于曲精细管基膜上的一类原始精原细胞,近年来因其在生产转基因动物方面有广阔的应用前景,受到了极大的关注。在胚胎发育前期,一小部分细胞分化形成原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）,并迁移至生殖嵴,PGCs随后增殖分化形成生殖母细胞并迁移至睾丸基底膜,随着雄性动物出生,生殖母细胞迁移至细精管并转化成SSCs。本文概述了近年来SSCs的研究进展,主要包括SSCs的分离、鉴定、体外培养体系以及SSCs诱导精子。此外,本文重点阐述了SSCs的研究前景。     

利用不同基因转移方法构建转基因红鲤

本实验研究了大黄鱼肌肉生长抑素前肽基因对红鲤的促生长作用。分别通过RT-PCR和PCR从大黄鱼(Larimichtys crocea)和pIRES-EGFP质粒扩增得到了肌肉生长抑素(MSTN)前肽基因及核糖体内部进入位点序列(IRES)-增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)片段,经测序验证正确后,构建了Tol2转座子供体质粒pT2AL200R150G-MSTN propeptide-IRES-EGFP。通过精子介导法(S1、S2组)、电穿孔法(E1、E2组)及基因枪法构建转基因红鲤(Cyprinus carpio),孵化72h后的鱼苗经荧光显微镜检测,EGFP表达阳性率为:精子介导法S1组38%,精子介导法S2组48%,电穿孔E1组47%,电穿孔E2组53%,基因枪组2%;孵化10d的仔鱼RT-PCR检测EGFP和MSTN前肽基因阳性率为:精子介导法S1组35%,精子介导法S2组45%,电穿孔E1组45%,电穿孔E2组55%,基因枪组1.8%。孵化后75d转基因红鲤与对照组相比,体长和体重分别提高了21.31%和27.59%。本实验结果表明,精子经高渗、低渗保存剂处理并通过电穿孔作用可大幅提高基因转移效率。     

影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素

探讨胚龄培养液、细胞因子、饲养层细胞等因素对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响。以4～13周龄流产胎儿生殖嵴或性腺为材料，小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、人胎儿成纤维细胞(hEF)、STO细胞和牛胎儿成纤维细胞(bEF)作饲养层，高糖DMEM(Dulbecco's minimum Eagle’s medium)为基础培养液，添加10^-4mol／L 2Me(2-巯基乙醇)、胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBS)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞冈子(SCF)等为培养液，探讨影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素。结果表明7～12周流产儿适于人类胚胎生殖细胞的分离克隆；人类胚胎生殖细胞体外培养以添加15％FBS为宜：添加4ng／mL LIF 4ng／mL bFGF 20ng／mL SCF能明显改善人类胚胎生殖细胞的分离克隆；MEF、STO、bEF和hEF可提高人原始生殖细胞(PGCs)的贴壁率，能促进PGCs源的人类胚胎干细胞(ES)的分离效率；以MEF作为饲养层效果较好。     

鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的表达谱分析

为研究microRNA(miRNA)在鸡胚早期性分化过程中的表达,探讨miRNA在性腺早期发育中的作用,本研究从前期以3.5～6.5 d的雌、雄鸡(Gallus gallus)胚胎性腺为材料的miRNA芯片表达谱中筛选出6个性别差异表达的miRNAs(其中miR-551b和miR-612为鸡新miRNAs),采用RNA加尾以及引物延伸的半定量RT-PCR方法研究这些差异表达miRNAs在3.5～6.5 d雌、雄鸡胚性腺中的表达,并验证其中新miRNAs的茎环前体结构.RNA folding软件折叠结果表明,预测的鸡miR-612和miR-551b均具有茎环状的前体结构.半定量结果表明,这6个miRNAs均存在不同程度的性别差异表达.除4.5 d外,gga-miR-612和gga-miR-1456在其它检测时期的表达为雌性高于雄性;在4.5～6.5 d鸡胚性腺中,gga-miR-551b在雄性中表达显著高于雌性(P<0.05);gga-miR-126在3.5和6.5 d雌性性腺中的表达低于雄性,而4.5和5.5 d则相反;gga-miR-1599在所检测时期中均为雄性中高表达且在4.5 d达极显著水平(P<0.01),gga-miR-10b的表达与之相反.根据表达谱结果推测gga-miR-551b以及gga-miR-1599可能涉及早期鸡胚性腺发育过程.     

抑制芳香化酶活性对鸡性腺分化的影响

鸟类性腺的分化除抗缪氏管激素和雄激素的参与外,雌激素也调节这一过程,雌激素的合成由芳香化酶催化而成。在性分化前用芳香化酶抑制剂（ＡＩ）阻断芳香化酶的活性,以抑制激素的合成,雌性鸡胚的性腺则可发育成为雄性。本实验在受精卵性分化前注入ＡＩ、睾酮（Ｔ）、或ＡＩ＋Ｔ,取出七日龄雏鸡性腺并按常规方法进行石蜡切片和染色。结果表明：ＡＩ及ＡＩ＋Ｔ处理的雌性鸡胚发生了性腺反转。性反转雌鸡的性腺左侧大于右侧大于右但     

牛皮肤成纤维细胞的分离培养与人溶菌酶基因的转染研究

摘要：为得到转染人溶菌酶基因的核供体细胞,采用组织块贴壁法分离培养牛耳成纤维细胞,经传代纯化培养,绘制生长曲线,将纯化好的带有人溶菌酶和绿色荧光标记基因的载体用脂质体法转入第4代成纤维细胞。24 h后荧光显微镜下检测到有绿色荧光蛋白表达,经500mg/ml G418筛选2周后,G418减半继续培养2～3代 ,PCR检测到有目的条带,说明目的基因已成功导入,因此本研究中获得的转基因牛耳成纤维细胞可能作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究。     

转CBF1基因增强水稻的耐逆性

为改良水稻(Oryza sativaL.)的耐逆性,以来源于成熟种子的胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐逆相关CBF1基因导入粳稻品种秀水11基因组,经GUS组织化学染色、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得一批转基因植株。T1代检测结果显示,所转基因已遗传给后代,且大多数株系的分离比符合3∶1。试验表明,在高盐与高渗胁迫下,转基因株系较非转化对照具有显著或极显著生长优势,表现苗高负增长率较小,长出的根数较多,根长较长;经低温胁迫处理后,转基因株系的叶片相对电导率显著或极显著低于对照。这些结果证明水稻转基因株系的耐逆性得到了增强。     

Hsd3β2基因RNA干扰载体构建及对鸡ESCs向PGCs分化的调控

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为配子的原始祖细胞,参与胚胎生殖细胞的发育过程。类固醇激素通路中3β羟基类固醇脱氢酶2(3β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,Hsd3β2)能促进细胞分化,但其对原始生殖细胞的形成具体调控机制还不得而知。本研究旨在通过构建类固醇激素合成过程中关键基因Hsd3β2的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)干扰载体并研究其对鸡(Gallus gallus)胚胎干细胞分化为原始生殖细胞的影响。通过慢病毒包装Hsd3β2感染鸡胚胎干细胞并进行RNA干扰(RNA interference,RNAi)诱导,分别于2、4、6 d观察细胞形态变化并收集细胞样品,q RT-PCR检测Hsd3β2、生殖标记基因鸡Vasa基因同系物(chicken vasa homologue,Cvh)、鸡KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(chicken KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase,C-kit)及甾类激素合成信号通路下游基因细胞色素P450亚酶(cytochrome P450 subenzyme,Cyp1a1)、葡萄糖醛酸转移酶1A1(UDP glucuronosyltransferase family 1member A1,Ugt1a1)和17β羟基类固醇脱氢酶7(17beta-hydroxysteroid dehydrogenase7,Hsd17b7)表达;流式细胞检测诱导产生类胚体阳性率;在鸡胚孵化过程中鸡胚注射慢病毒干扰载体,孵化4.5 d后收集生殖嵴,q RT-PCR检测Cvh、C-kit及下游基因Cyp1a1、Ugt1a1和Hsd17b7表达;流式细胞分析原始生殖细胞生成效率。本实验成功构建sh-Hsd3β2慢病毒载体,挽救实验表明过表达Hsd3β2能使sh RNA引起的基因表达下降回升;在体外诱导过程和鸡胚孵化过程中,q RT-PCR结果表明干扰Hsd3β2后,甾类激素合成信号通路中的下游基因的表达显著下调(P0.01);在RA诱导实验过程中,随诱导时间推进,类胚体数量逐渐增加。Hsd3β2抑制后,类胚体形成数量减少。Cvh、C-kit在诱导过程中上调表达,但Hsd3β2干扰后,其表达显著降低(P0.01),流式细胞分析表明干扰Hsd3β2后,诱导4d后产生类胚体阳性细胞(3.27±0.19)%显著低于对照组(7.39±0.09)%;体内实验结果表明干扰Hsd3β2后,Cvh、C-kit表达显著降低(P0.01),生殖细胞数量显著减少。本研究结果表明Hsd3β2能通过甾类激素合成信号通路促进原始生殖细胞的形成,为研究该通路对原始生殖细胞形成具体机制提供理论基础。     

胚盘下腔注射法将外源质粒pEGFP-N1导入鸡胚的研究

研究运用胚盘下腔注射法将外源质粒pEGFP-N1导入鸡胚,通过检测外源基因表达载体在鸡胚发育过程中的动态代谢、与宿主基因组整合情况,进而对该模式在制备转基因鸡和基因功能研究中的可能性进行探讨。取新鲜鸡胚为实验材料,胚盘下腔注射pEGFP-N1,石蜡膜封口后孵化,于不同时间段采集鸡胚及出雏鸡组织样,PCR方法检测pEGFP-N1的分布及其降解情况。同时,对酶切、回收后的阳性样本基因组用PCR检测了外源质粒与基因组DNA的整合情况。研究结果表明：实验组0.5、1、3、4、5和6日龄鸡胚以及初生雏鸡中均可检测到外源质粒pEGFP-N1上的EGFP基因,阳性率分别为100%、80.00%、66.57%、75.00%、64.29%和84.21%。随着鸡胚的发育,外源质粒会被逐渐代谢掉,出雏时实验组雏鸡的阳性率为75%。但是,阳性样本基因组经HindⅢ酶切后PCR检测结果表明,pEGFP-N1未与宿主染色体产生整合,而是以游离或者多聚状态存在于鸡胚组织中。     

鸡传染性支气管炎病毒肾致病株的分离和鉴定

从广西13个鸡场,有呼吸道症状及尿石症的病鸡中分离出 C、G、Z、Q4株病毒。病毒经电镜观察,其大小在94～108nm 之间,囊膜外有特征性疏松排列的刺突。敏感鸡接种16～36小时后出现呼吸道症状,剖检病鸡时大多数鸡肾肿大并有尿酸盐沉积。各毒株接种鸡胚都能产生体儒胚;被56℃1小时灭活;在鸡胚中均能干扰鸡新城疫病毒 LaSota 株的生长。C_(19)株可被鸡传染性支气管炎病毒标准阳性血清所中和。G_3不被 IUDR 所抑制,属 RNA 病毒;对乙醚敏感,证明属有囊膜病毒。从以上各项鉴定指标证明,所分离的4株病毒是引起鸡尿石症的传染性支气管炎病毒。据作者的经验,提出分离鸡传染性支气管炎病毒较为合理的模式。     

单色绿光环境对孵化中种蛋蛋壳理化特性的影响

蛋壳是鸡胚发育过程中与外界环境进行气体和热量交换的重要媒介,其结构、形态等因素均为影响鸡胚发育的重要因素。单色绿光照射可缩短种蛋孵化时间,促进出雏、提高种蛋孵化率。有鉴于此,该研究针对单色绿光调控孵化过程中的种蛋蛋壳色度、蛋壳结构、色素含量及元素含量等因素进行监测,从种蛋蛋壳特性变化的角度探究单色绿光在种蛋孵化过程中促进雏鸡出雏的机制。结果表明,与传统黑暗孵化环境相比较,孵化过程单色绿光形成的光环境促使蛋壳对孵化环境产生适应性响应,蛋壳表面亮度显著降低（P<0.01）,抑制了蛋壳中绿色色素-胆绿素的分解（P<0.01）。且单色绿光有助于鸡胚吸收利用蛋壳中的Ca元素,显著促进孵化过程中蛋壳表面孔隙面积的风化增大（P<0.000 1）,提高蛋壳的通透性及散热效果,利于出雏期间雏鸡出壳,有助于促进出雏并降低孵化死亡率。该研究阐析了单色绿光孵化过程中种蛋蛋壳特性的变化,为单色绿光促进种蛋出雏及其在孵化产业的应用奠定了一定的理论基础。     

鸡胚精原干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

研究体外定向诱导鸡胚精原干细胞(spetmatogonial stem cells,SSCs)向脂肪细胞分化的能力.取孵化16 d的鸡(Gallus gallus)胚睾丸,提取SSCs,体外培养和传代.采用不同的诱导程序和不同组合的诱导剂(地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX))诱导SSCs向脂肪细胞分化.结果显示,诱导SSCs7～2l d后,分化成脂肪细胞,其中地塞米松、胰岛素和IBMX联合使用3 d后更换为胰岛素作用l d,经过3次循环后,用胰岛素继续处理至21 d,这一方法的诱导分化效果较好,分化率为85%.高于诱导剂联合协同作用的诱导效果(P<0.01).同时诱导剂联合作用协同作用的诱导效果高于单独作用的诱导效果(P<0.01).诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性,并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ.表明SSCs体外培养传代后仍具有多向分化潜能,在特异性化学物质的诱导下,可被定向诱导分化为脂肪细胞.     

不同孵育时间对猪精子转染外源DNA效果的影响

建立稳定的精子载体法技术体系对家畜的转基因育种等研究具有重要意义.为获得公猪精子与DNA最佳共孵育时间,优化建立猪精子载体法技术体系,本研究通过定量PCR、荧光显微镜检测和精液常规分析方法等,研究分析猪精子与DNA不同共孵育时间对猪精子活力、活率、DNA转染率、吸附DNA和内化DNA量的影响.结果表明,多聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹的标记DNA与精子共孵育15、30、60和90 min后,随着孵育时间的延长,精子活力和活率有极显著下降(P＜0.01),而精子转染率呈极显著(P＜0.01)或显著(P＜0.05)上升,吸附外源DNA量和内化外源DNA量也呈上升趋势,但是30 min后不同孵育时间之间差异不显著(P＞0.05).此外,随着共孵育时间的延长,与精子转染率提高幅度相比,精子活力和活率的下降幅度更明显.综合考虑精子活力、活率、转染率、吸附DNA量和内化DNA量等参数,猪精子与外源DNA共孵育时间以30 min为最佳.