锌指核酸酶(ZFN)介导的牛肌肉抑制素基因(MSTN)突变的研究

肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉发育的负调控基因,突变后会引起肌肉的过度发育,在肉用动物育种中有非常重要的价值。本研究利用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)对牛(Bos taurus)MSTN基因的第二外显子特异性剪切,诱导该基因的突变,从而达到敲除该基因的目的。首先对脂质体介导的双质粒共转染牛成纤维细胞的条件进行优化,获得的共转染效率高达19.27%;之后利用两组ZFNs对牛成纤维细胞进行转染,单细胞通过口吸法移入96孔板,经扩大培养后进行PCR筛选,获得18株MSTN基因突变细胞株,其中包括一株双等位基因敲除的细胞系,两组ZFNs对牛成纤维细胞的突变效率分别为6.05%和3.84%;最后,挑选一株突变细胞系进行体细胞核移植研究,共获得24枚重构胚;将去除透明带的重构胚培养于2i培养液中,获得囊胚来源的类滋养层干细胞,通过PCR和测序检测,证明该细胞系在MSTN基因第二外显子具有与供体细胞相同的突变。结果表明,所合成的两组ZFNs可以在MSTN作用位点引起突变,具有很高的突变效率,而且能获得双等位基因突变的细胞株,获得的细胞株能够用作体细胞核移植的供体细胞。本研究为肉用牛的品质改良和育种工作提供了基础资料。     

猪肌肉生长抑制素(MSTN)前肽定点突变载体的构建及其原核表达

肌肉生长抑制素(MSTN)能够限制肌纤维的增粗增大,而突变的肌肉生长抑制素前肽(Pro-MSTN-D75A)能阻止MSTN与相应受体的结合,从而解除MSTN对肌纤维的抑制作用。猪是我国最重要的肉用家畜,通过操作MSTN提高其瘦肉产量,将对我国生猪生产具有特殊意义。本研究用通城猪妊娠3个月的胚胎为材料,提取背最长肌RNA并以此为模板,用反转录PCR扩增猪MSTN前肽cDNA序列(不含信号肽),并将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上。通过定点突变将编码天冬氨酸的密码子变为丙氨酸密码子(D75A),构建了原核表达载体pGEX-ProM(SP-)和pGEX-ProM(SP-)D75A。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞并经IPTG诱导表达,结果表明,转化pGEX-ProM(SP-)质粒的E.coliBL21工程菌用终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导5h表达情况最好;而转化pGEX-ProM(SP-)D75A的工程菌在1mmol/L的IPTG诱导6h的条件下表达情况最好。用GST-Trap蛋白纯化系统纯化回收总分子量大小约为51kD融合蛋白(GST蛋白标签分子量为26kD,MSTN前肽蛋白分子量为25kD)。纯化蛋白的浓度ProM(-SP)为1.87mg/mL,ProM(-SP)D75A为1.21mg/mL。本研究建立了大肠杆菌表达猪MSTN前肽的最佳条件,提高了生产效率,并为研究MSTN前肽在动物体内的生物学功能以及制备单克隆抗体提供基础资料。     

建鲤生长抑制素基因(MSTN)的分离、表达及多态性与体型、平均日增重相关性研究

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是近年来发现的肌肉生长负调控因子,属转化生长因子p(transforming growth factor-β,TGF-β)家族.本实验使用PCR方法从建鲤(Cyprinus carpio var.jian)基因组分离到4个jlMSTNs基因,4个基因具有相同的基因结构,同源性分析表明,两两分属于鱼类MSTN1和MSTN2,分别命名为jlMSTN1a、jlMSTN1b、jlMSTN2a和jlMSTN2b.jlMSTN1s和jlMSTN2s的两旁基因阅读框碱基相似性很高,分别为96%和94%,但内含子存在着长度和序列差异,jlMSTN2a两内含子明显比jlMSTN2b长,分别为1 384、1 763 bp和879、835 bp.jlMSTNs在不同组织的表达量以及各基因上SNP位点数表明,jlMSTN1s所受的选择压力高于jlMSTN2s;jlMSTN2a所受的选择压力大于jlMSTN2b.本实验还筛选到与建鲤体型和平均日增重相关的SNP位点各1个,可作为辅助育种标记.     

反义RNA干扰MSTN对牛肌肉卫星细胞脂肪生成相关基因的影响

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员,在骨骼肌中高表达;敲除MSTN后,肌肉质量增加、脂肪含量变少,但抑制MSTN表达后,如何影响脂肪沉积,尚未研究清楚.为了探究抑制MSTN表达后对脂肪相关基因表达的影响,本研究利用反义RNA技术,成功构建了双向表达载体pMSTN-CMV-CAG-antiMSTN,并通过Western blot筛选出抑制效果最佳的MSTN的反义载体.利用最佳反义MSTN载体在牛(Bos taurus)肌肉卫星细胞中有效干扰MSTN表达后,检测了脂肪合成相关基因(脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN),乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1))、脂肪酸氧化分解相关基因(肉毒碱棕榈酰转移酶ⅠB(carnitine palmitoyltransferase 1b,CPT-ⅠB),乙酰辅酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase,ACOX1)和烯酰辅酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase 1,ECHDC1))以及脂肪转运蛋白(fatty acidtransport proteins,FATP)表达的变化.结果显示,在MSTN基因被干扰后,肌肉卫星细胞中脂肪酸合成相关基因表达量上调,脂肪氧化分解相关基因中ACOX1和CPT-1B表达量上调,而ECHDC1基因表达量下调,另外,FATP表达基本没有变化.MSTN功能缺失后,脂肪合成和脂肪氧化分解过程都得到了加强,所以MSTN敲除所导致的脂肪减少并不是由于抑制了脂肪合成,而是由于脂肪分解加强,为肌肉提供更多的能量.MSTN下调后,CPT-1B的表达上调最为显著,而CPT-1B是脂肪酸β氧化的关键基因,所以研究结果提示MSTN对于脂肪的影响主要是通过影响β氧化过程实现的.研究结果为MSTN下调所导致的脂肪含量下降提供了理论依据,为MSTN作用于脂肪沉积的机制做出了初步探讨.     

猪诱导多能干细胞(iPS)嵌合胚胎的制备

猪诱导多能干细胞(iPS)具有自我更新和多向分化潜能,是医学和细胞生物学研究理想的材料。为了探索猪iPS细胞的胚胎嵌合能力,本实验采用piggyBac转座子系统PB[Act-RFP]DS和Act-PBase载体,共转染猪iPS细胞,获得带有红色荧光标记的猪iPS细胞株PS24-R。并通过显微注射方法,将供体细胞PS24-R注入到4~8细胞期的胚胎腔隙,制备嵌合胚胎,待其继续发育至囊胚阶段,统计PS24-R细胞在胚胎中的嵌合情况。结果显示,通过转座子系统piggyBac标记的猪PS24-R细胞能够稳定表达红色荧光,以其作为供体细胞制备猪嵌合胚胎能够有效观察iPS细胞在胚胎中的嵌合情况。将1、5和10个猪PS24-R细胞和1个猪PS24-R细胞团分别注射到猪胚胎中构建嵌合胚胎,随着猪iPS细胞注射数量的增加,注射胚胎的囊胚率逐渐下降,但嵌合比例逐渐升高。同时与孤雌胚胎相比,嵌合胚胎中多能基因OCT4、SOX2和NANOG表达显著提高。由此可见,采用piggyBac转座子标记的猪PS24-R细胞能够在猪早期胚胎发育阶段实现嵌合,为iPS细胞嵌合猪的生产提供了基础资料。     

CRISPR/Cas9介导绵羊成纤维细胞MSTN基因突变系统的构建

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。     

猪促甲状腺激素β基因(TSH-β)多态分布及与经济性状的关联分析

为研究猪促甲状腺激素口基因(TSH-β)的多态分布情况及与生长肉质性状的关联性,本研究对TSH-β基因全序列进行再测序,发现3个单核苷酸突变座位:位于5'非转录区多态座位A-175G、位于编码区非同义突变座位G+52A,以及位于内含子的突变座位G+570A.采用PCR-RFLP和四引物ARMS-PCR方法对皮特兰、长白、杜洛克、约克夏、金华猪、岔路黑猪和嘉兴黑猪七个纯种猪群以及金皮资源家系F2代群体共计548头个体进行多态分型,并在F2代群体中分析了TSH-β多态座位与生长和肉质性状的关联性.结果表明,猪TSH-β基因具有较高的遗传多样性(Shannon多样性指数总体均值为0.48),且存在相当程度的品种间遗传分化(Fst=0.5389).其中,座位A-175G在4个国外品种和岔路黑猪中的优势等位基因为A,而在金华猪和嘉兴黑猪中的优势等位基因为G,关联分析显示AA型个体在胴体长、日增重、后腿重和后腿肌肉重方面显著高于GG型个体(P<0.05):座位G+52A的多态性主要存在于金华猪中,而在其他猪种中表现为低杂合度或完全纯合于等位基因G,且与肌内脂肪含量有显著关联;座位G+570A的多态性仅存在于我国的嘉兴黑猪和金华猪中,其他猪种表现为完全纯合于等位基因G,关联分析结果表明GG型个体在胴体长和后腿肌肉重方面显著高于AA型个体.研究结果提示,TSH-β基因可考虑为猪4号染色体相关QTL的功能候选基因.     

体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率.     

应用牙釉蛋白(AML)基因鉴别牛早期胚胎性别

牛牙釉蛋白（AML）基因定位于牛X染色体和Y染色体上的同源区域.实验根据牛X、Y染色体AML基因第五内含子上序列同源性只有45.1%以及X、Y染色体该区段之间存在多处碱基缺失的特点,合成了1对性别特异性引物.该引物经扩增后母牛只得到1条467 bp的来自X染色体的扩增条带,而公牛能得到1条源自X染色体的467bp片段的扩增条带和1条源自Y染色体的341 bp的扩增条带.经基因组DNA验证,该引物的公母鉴定准确率为100%,同时该对引物具有高度的牛特异性.定量分析AML基因引物的反应灵敏度,发现1次PCR（30个循环）能扩增出0.5ng的基因组DNA,2次PCR（共50个循环）能扩增出20pg的基因组DNA.将AML基因引物与SRY基因引物的反应灵敏度相比较,结果表明前者的灵敏度比后者的高8～10倍.用AML基因反应体系鉴定了26枚优质胚胎,其中24枚有扩增结果,13枚鉴定为公牛,11枚鉴定为母牛.     

利用等位基因特异性PCR技术检测番茄高色素基因hp1和hp2的SNP

摘要：番茄高色素基因hp1和hp2突变体与野生型基因相比均发生了单碱基的点突变,常规PCR技术很难把它们区分开。本试验对碱基错配类型和位置与特异性PCR的关系进行了研究。结果表明：引入TA-TG双碱基错配的引物,退火温度在49.3+0.1℃时能把hp1基因的突变位点和野生型的对应位点区分开来。引入T-C碱基错配的引物,退火温度在53.5+0.1℃时能把hp2基因的突变位点和野生型的对应位点区分开来。错配碱基在引物3′端的位置对PCR的特异性影响不大。     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

五指山小型猪生长激素及其受体基因的克隆与序列分析

动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程,受多种因素如神经、体液、遗传、营养及环境等的影响。其中,动物神经内分泌生长轴各因子(激素、受体、结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着关键的作用。正常情况下,下丘脑接受体内外的信息,生长激素释放激素(grow thhorm one releasing horm one,GHRH)和生长抑素(som atostatin,SS),调节垂体生长激素(grow thhorm one,GH)的分泌,GH通过与生长激素结合蛋白(grow th horm one b ind ing protein,GHBP)结合而运输,与靶器官上的生长激素受体(grow th horm one receptor,GHR)结合,促使类胰岛素生长因子(insu lin-like grow th factors,IGFs)的产生并进入血液循环,IGFs再通过其结合蛋白(insu lin-likegrow th factor b ind ing protein,IGFBP)转运到全身组织细胞,促使组织细胞的生长与分化。五指山猪(Wuzhishan Pig,WZSP)是一种原产于中国海南省山区的小型猪。五指山猪成年体重仅为35 kg,是正常猪体重的15%~30%,是一种频临灭绝的珍稀物种。五指山猪具有以下特征:体型小,性成熟早,肉质好,耐近交和遗传稳定。为了开发和应用这一珍稀猪种的遗传资源,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从1989年就已经开始对五指山猪进行近交系培育,现在已经获得五指山猪近交系18代(近交系数为0.974),但五指山猪的矮小机理至今不明。为了探讨五指山猪矮小的分子机理,对五指山猪生长激素及其受体基因进行了克隆和序列分析。从纯种近交16代五指山猪的垂体和肝组织提取总RNA,根据GenBank中猪生长激素及其受体基因的序列(登录号分别为X53325,NM214254)设计特异性引物,对五指山猪生长激素及其受体基因进行扩增,然后对PCR产物进行回收、克隆测序。测序结果表明,五指山猪生长激素基因开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸,其中包含26个氨基酸的信号肽;生长激素受体基因编码区编码639个氨基酸,其中包含18个氨基酸的信号肽。运用生物学软件DNAssist 2.2将五指山猪和普通猪的生长激素基因编码区进行比对发现,五指山猪生长激素基因的编码区有4个突变:26号位置发生C→T突变,该突变导致缬氨酸代替丙氨酸;65号位置发生G→A突变,该突变导致谷氨酰胺替换精氨酸;114号位置发生T→C突变,252号位置发生A→G突变,但是这两个突变都未引起所编码氨基酸的变化。五指山猪和普通猪生长激素受体基因比对发现,1143号位置的G→T突变引起天冬氨酸替换谷氨酸;1225号位置的G→T突变导致丝氨酸替换丙氨酸;1666号位置C→G突变导致缬氨酸替换亮氨酸;1739号位置C→G突变导致丙氨酸被甘氨酸所代替;1801号位置G→A突变导致缬氨酸被异亮氨酸代替;1248号位置G→A突变,1287号位置G→A突变和1827号位置G→C突变均为同义突变,未引起相应编码氨基酸的变化。五指山猪生长激素基因有两处氨基酸替换,这两处替换发生在信号肽区,对成熟蛋白的结构和功能没有影响,但是有可能会影响蛋白的运输。五指山猪生长激素受体基因突变都发生在生长激素受体的胞内结构域,这些突变可能改变生长激素受体的空间构像,从而对生长激素受体的胞内信号转导产生一定的影响,影响生长激素-生长激素受体-胰岛素样生长因子轴的信号级联,削弱生长激素的促生长作用。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)的克隆及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系三大成员之一,被认为是纤维素糖化的限速酶。本研究克隆黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1),并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达分析。以GenBank上黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)序列为模板,设计特异性引物,从黑曲霉(Asperjillus niger)基因组DNA中扩增目的片段,通过SOE-PCR的方法将猪腮腺分泌蛋白信号肽序列sp和bgl1相连,成功构建分泌型真核表达载体pc6-sp-bgl1,利用脂质体介导法瞬时转染哺乳动物CHO细胞,通过RT-PCR和Western blot检测,最后通过DNS(dinitrosalicylic acid)法测定表达产物酶学活性。PCR扩增得到的目的序列与文献报道序列的相似性为91%,预测的蛋白氨基酸序列相似性为99%。RT-PCR和Western blot检测证明,外源基因bgl1在CHO细胞中得到表达;分泌到细胞培养上清中的重组蛋白对水杨素的水解活性为1.74U/mL,说明重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。本研究克隆得到黑曲霉bgl1基因并在哺乳动物CHO细胞中进行表达,为β-葡萄糖苷酶在单胃动物中的利用提供了基础研究资料。     

梅山猪氨肽酶基因N(pAPN)cDNA克隆、序列分析及重要变异位点的筛选

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)蛋白是猪(Sus scrofa)传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪的流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)等一系列冠状病毒的受体蛋白。为探讨梅山猪APN基因的分子结构特征以及重要的变异位点,本研究通过PCR扩增和测序技术,结合生物信息学分析梅山猪APN基因功能区域和重要变异位点,对其蛋白质结构进行预测和分析。结果表明,梅山猪APN基因cDNA全长2 886 bp(GenBank登录号:KF280271),含有20个外显子,编码961个氨基酸。与GenBank数据库公布的标准序列(登录号:NM_214277.1)相比,梅山猪APN基因编码区变异共引起10处氨基酸突变与2处氨基酸缺失,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108 Ile、Ser330Pro、Trp399Arg和Glu465 Gly等6处突变位于APN酶催化活性区域,Gln747His突变、748Tyr和749Ser缺失突变位于APN病毒结合区域。蛋白结构和编码产物功能分析发现,pAPN为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有1个跨膜螺旋(跨膜区位于12~34氨基酸,二级结构元件以α螺旋和β折叠为主,编码产物主要参与细胞被膜(cell envelope)、中央中间代谢(central intermediary metabolism)、辅酶因子生物合成(biosynthesis of cofactors)等功能。Gln747His、748Tyr和749Ser缺失突变可能与氨肽酶N结合病毒能力有关。本研究对梅山猪pAPN基因功能的分析及变异位点的筛选,为今后筛选猪抗病毒性腹泻的有效遗传标记提供理论基础。     

植物基因定点突变与定点置换技术及其在作物遗传改良中的应用

随着大量植物基因组测序工作的完成及EST数据库的充实，利用基因定点突变与定点置换技术精细的研究基因功能是功能基因组学研究的重要手段。同时，基因定点突变与定点置换技术可以克服现有转基因技术的基因沉默和位置效应等诸多缺陷，在植物遗传改良方面具有重要的意义。基因定点突变与定点置换技术在酵母和小鼠胚胎干细胞中已经比较成熟，但在高等植物中同源重组频率非常低，限制了其使用。新近研究发现，利用锌指核酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）引入DNA分子的定点断裂（double-strand breaks, DSBs）可以高效介导基因的同源重组，使得ZFN成为遗传工程的一个研究热点。利用嵌合寡核苷酸(Chimeric oligonucleotides)可以介导基因的单碱基定点突变，在植物遗传改良上有广阔的应用前景。对同源重组相关的调控途径进行基因修饰也可以提高植物的基因打靶效率。植物基因定点突变与定点置换技术难题的攻克，必将加快植物功能基因组研究的步伐，同时给植物基因工程育种带来新的革命。     

苹果腐烂病菌VmHMG基因敲除突变体获得及表型分析

苹果腐烂病菌是引起我国苹果腐烂病的主要病原真菌,对苹果产业造成了严重的经济损失。为有效控制病害的发生,本试验研究了VmHMG对苹果腐烂病菌的生长发育及致病性的影响。本研究通过融合PCR技术将苹果腐烂病菌HMG-box基因上下游片段与及潮霉素筛选标记基因Hpt片段,构建敲除载体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化,再经潮霉素初筛、PCR扩增和Southern杂交验证,最终从95个转化子中得到2株敲除突变体Δ1-5、Δ2-22,敲除效率为2.1%。与野生菌株相比,Δ1-5、Δ2-22在菌落颜色、子实体产生等方面没有发生明显变化;突变株平均生长速率分别下降了10.8%和19.8%,但致病性分别增加了48.5%和56.2%。由此可知,VmHMG基因缺失抑制了苹果腐烂病菌的生长,增强了其致病性,对其他性状影响不明显。本研究通过获得VmHMG基因敲除突变体,初步分析了该基因的功能,为明确病菌的生长发育及致病作用机制奠定了理论基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失毒素1激活基因C(ApxIC)同时嵌合副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2基因(ompP2)复合突变株的构建

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)以及副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是引起猪发病的2种病菌。本研究以APP血清5型分离株(SW1)为基础材料,通过构建重组转移载体pBOSKΔIC-1和pBOSKΔIC/ompP2,构成卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正负双向筛选表达盒,并筛选获得SW1株缺失毒素I的激活基因C(ApxIC),同时嵌合Hps外膜蛋白P2基因(ompP2)的复合突变株SW1ΔApxIC/ompP2。该突变株经鉴定,与SW1亲本株相比,其缺失了大小为475bp的apxIC基因,同时嵌合有大小为1107bp的Hps ompP2基因,其基本生长特性与亲本株(SW1)没有显著区别;同时在体外,连续传代10代之后缺失的apxIC基因不会发生回复突变,嵌入的ompP2基因仍能够稳定遗传。本研究成功构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失apxIC基因并嵌合有Hps ompP2基因复合突变株,为今后研究APP和Hps新型二联疫苗打下基础。     

表皮生长因子受体基因(EGFR)多态性及其与山羊产羔数的相关分析

表皮生长因子受体是雌性生殖功能的关键因子,本研究旨在分析表皮生长因子受体基因(epidermal growth factor receptor,EGFR)的多态性与山羊繁殖性能之间的关系.参考牛的EGFR基因序列设计14对引物,采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测在西南地区具有代表性的10个山羊(Cap ra hircus)品种(马头山羊、波尔山羊、古蔺马羊、川东白山羊、大足黑山羊、贵州白山羊、金堂黑山羊、板角山羊、成都麻羊和南江黄羊)中EGFR基因的单核苷酸多态性,并且在贵州白山羊、古蔺马羊和川东白山羊中分析EG FR基因多态性与山羊繁殖力之间的相关性.结果显示,14对引物中有2对引物(P3和P13)的扩增片段出现多态性.对于P3的扩增片段,在不同的山羊品种中检测到AA、AB和BB三种基因型,测序分析表明BB基因型与AA基因型相比有一处单碱基突变(115837C→T).在3个品种中,AA基因型和AB基因型的产羔数最小二乘均值差异不显著(P＞0.05),BB基因型的样本非常有限,没有统计意义;对于P13的扩增片段,在不同的山羊品种中检测到GG、HH和GH型三种基因型,测序分析表明HH基因型与GG基因型相比有一处单碱基突变( 173015 G→A).GG基因型在贵州白山羊和川东白山羊中产羔数最小二乘均值显著高于GH基因型(P＜0.05),而在古蔺马羊样本中只存在GG基因型,HH基因型的样本在三个品种中都很少存在.本研究初步表明,EGFR基因可能是影响山羊产仔数性状的一个主效基因或是与该性状紧密遗传连锁的一个分子遗传标记.     

睾丸特异蛋白Y基因(TSPY)对奶牛早期胚胎性别的鉴定

为方便性别鉴定方法在现场应用,利用睾丸特异蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法.设计并合成了TSPY雄性特异和雌、雄共有基因引物,并利用已知性别的奶牛血液DNA为模板,初步建立了性别鉴定的PCR反应体系和非电泳的性别鉴定方法.灵敏度试验结果显示,雄性特异引物和共有基因引物对在模板10～60 Pg时,其性别鉴定的准确率为100%,提示TSPY基因具备鉴定胚胎性别的可能;同时采用非电泳法和环介导的等温扩增(LAMP)法鉴定6枚胚胎的性别,两者结果完全一致;用非电泳法检测TSPY基因鉴定了43枚胚胎的性别,对其中鉴定为雌性的21枚胚胎分别移植给自然发情后6～8天的受体,结果9头出生的犊牛均为母牛.结果表明.TSPY基因是一个很好的雄性特异标记,非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠.     

水牛催乳素受体基因克隆及序列分析

扩增出广西本地沼泽型水牛（Bubalus bubalis）催乳素受体（PRLR）基因部分保守序列,用于下一步实验检测体外培养的水牛乳腺上皮细胞中催乳素受体基因的表达水平。根据已报道的奶牛催乳素受体基因cDNA序列的保守区,设计一对特异性引物。提取广西本地水牛的乳腺组织总RNA,并以其为模板,以下游特异性引物为反转录引物,在反转录酶（AMV）作用下合成cDNA;用Ex-Taq酶进行PCR扩增,得到催乳素受体基因的保守序列,长度为571bp。该扩增产物经纯化后,连接到pMD18-T载体上扩增。经序列分析结果表明：序列较保守,与GenBank上发表的奶牛催乳素受体基因的同源性达到98．9％,与绵羊的同源性达到96．5％,与猪、小鼠、人的同源性分别为86．5％、78．9%、77．1％。催乳素受体基因与奶牛相比,共有6个碱基发生了突变,其中1个为同义突变,其他5个均为错义突变,形成4个氨基酸发生变异。