杠柳新苷Ｔ作用东方粘虫幼虫中肠细胞的免疫定位研究

【目的】明确杠柳新苷T作用后在东方粘虫幼虫中肠肠壁细胞中的分布,探讨其杀虫作用机制。【方法】鉴于杠柳新苷T对东方粘虫幼虫具有明显的胃毒活性,而对小地老虎幼虫无杀虫活性,采用胶体金免疫电镜技术,比较观察了杠柳新苷T处理的东方粘虫幼虫和小地老虎幼虫中肠肠壁细胞的变化。【结果】东方粘虫幼虫经杠柳新苷T处理后,胶体金颗粒首先出现在微绒毛上,且密度随着处理时间延长而逐渐增大,最终破坏微绒毛;同时,胶体金颗粒在细胞内的细胞器膜上也有出现,并损伤细胞器。小地老虎幼虫经杠柳新苷T处理后,中肠肠壁细胞及细胞器均没有明显变化,其上也没有发现胶体金颗粒的存在。【结论】杠柳新苷T对东方粘虫幼虫和小地老虎幼虫的选择性与其在2种试虫中肠肠壁细胞上的特异性结合存在显著差异有关,杠柳新苷T作用东方粘虫幼虫后的初始结合部位可能是其中肠肠壁细胞,推测杠柳新苷T的靶蛋白可能存在于中肠肠壁细胞膜及细胞器膜上。     

杀虫活性化合物杠柳新苷P对东方粘虫中肠细胞上结合蛋白的影响

杠柳新苷P是从杠柳根皮提取物中分离得到的一种甾体糖苷类化合物,对东方粘虫表现出较好的杀虫活性。为了进一步研究其杀虫机理,探究杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠疑似作用位点,通过对杠柳新苷P进行结构修饰,与东方粘虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)组织体外孵育,利用其结构修饰后增强的紫外吸收特性,经蛋白分离、纯化,进而得到杠柳新苷P作用于粘虫中肠BBMV上的结合蛋白。结果表明:在粘虫中肠BBMV上存在杠柳新苷P的疑似结合蛋白,且经分离鉴定得到5种疑似结合蛋白,分别为类异翅盘蛋白、氨肽酶、二硫键异构酶、苯基贮存蛋白以及精氨酸激酶;通过进一步的分析推测,氨肽酶可能是杠柳新苷P作用于东方粘虫幼虫中肠BBMV上的结合蛋白。初步明确杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠的疑似作用位点,但仍需进一步的验证工作进行确认,为今后研究杠柳新苷类化合物的作用机理及靶标提供依据。     

杠柳新苷P在水和土壤中的降解与移动特性

采用室内模拟试验,研究植物杀虫活性成分杠柳新苷P在不同水体和不同类型土壤中的降解与移动特性,分析其对不同水体与不同类型土壤的污染风险性。结果表明:温度和pH对杠柳新苷P在水中的降解均有一定程度的影响。温度为50℃、pH=9时,降解速率最快,其水解半衰期为2.36d。土壤降解与土壤淋溶试验表明,杠柳新苷P在麦田土、果园土和菜园土中的降解半衰期分别为4.33、4.25和3.85d,降解速率依次为菜园土果园土麦田土;对比试验研究表明,在未灭菌的土壤中,杠柳新苷P的降解速率比灭菌的土壤中显著加快。     

苦皮藤素Ⅳ对粘虫中肠组织影响的超微结构观察

采用电子显微镜技术研究了苦皮藤素 对粘虫(Mythimnaseparata(Walker))中肠组织的影响。电镜观察结果表明,苦皮藤素 对粘虫中肠肠壁细胞的质膜和内膜系统有一定影响。在苦皮藤素 作用下,试虫的柱状细胞顶膜微绒毛扩张;线粒体肿胀;粗面内质网扩张,囊泡化;杯状细胞与柱状细胞之间间隙增大。这表明苦皮藤素 破坏了中肠细胞的结构,使中肠肠壁细胞损伤及细胞间隙增大,导致毒物易于穿过肠壁细胞间隙进入血淋巴,进而到达作用部位。     

小地老虎V-ATP酶A亚基基因的克隆与分析

V-ATP酶是一种ATP依赖型的多亚基质子泵,广泛存在于多种生物的内膜和质膜上,参与生物体内多种重要的生理生化反应,为了进一步研究V-ATP酶,克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因。以鳞翅目昆虫小地老虎(Agrotis ypsilon)的中肠组织为材料,利用RACE技术克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因全长。结果表明:克隆得到A亚基基因序列2 693bp,其中CDS区1 851bp,编码616个氨基酸,翻译的蛋白质分子质量为68.06ku,等电点为5.14,含有3个N-糖基化位点。基因同源性分析结果说明该基因与棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟草天蛾(Manduca sexta)、小菜蛾(Plutella xyllostella)均有较高的同源性。A亚基基因序列已提交至GenBank并获得登录号KM434187。     

雷公藤甲素对粘虫中肠消化酶及其组织结构的影响

测试雷公藤甲素对粘虫中肠消化酶活性的影响 ,并对中毒试虫的中肠组织结构进行显微观察。结果表明 ,处理试虫脂肪酶活性在痉挛期和麻痹期分别下降 2 6 .0 %和 39.1% ,达极显著水平 ;淀粉酶、蛋白酶活性在各个时期的变化均不显著 ;中肠细胞变厚且混乱变形 ,组织许多部位呈消融状 ,肠壁细胞层排列不规则 ,柱状细胞与杯状细胞排列不整齐 ,并有纵肌、微绒毛脱落现象。     

转CpTI基因杨树对美国白蛾幼虫中肠解毒酶及乙酰胆碱酯酶的影响

以转CpTI基因毛白杨回交杂种 [(Populustomentosa×Populusbolleana)×Populustomentosa]叶片饲喂 4～ 5龄美国白蛾 (HyphantriacuneaDrury)幼虫 ,对其中肠解毒酶和乙酰胆碱酯酶活性进行了测定。结果表明 ,酯酶、羧酸酯酶的活力受到明显抑制 ,且随时间的延长抑制强度增加 ,饲喂 48h后 ,上述两种酶的活力分别比对照降低 76 .42 %和 73.91% ;多功能氧化酶在饲喂的前 12h ,表现为受到抑制 ,最大抑制率为 35 .78% ,2 4h后酶活力反而高于对照 ;谷胱甘肽S -转移酶和乙酰胆碱酯酶活力受到抑制 ,而且两者表现极为相似 ,均在饲喂后 4h抑制作用最强 ,酶活力分别比对照降低 5 1.40 %和 40 .5 7% ,但在整个试验过程中 ,均没有表现出随时间加强的趋势。     

不同温度对小地老虎实验种群的影响

研究了不同温度对小地老虎发育、存活、生殖、种群参数、种群趋势指数等的影响 .结果表明 :在 17- 35℃恒温内 ,小地老虎的发育速率随温度上升呈逻辑斯蒂曲线趋势 .该虫卵的孵化率 (SE)、幼虫的存活率 (SL)、蛹的存活率 (SP)、成虫产卵量 (E)和种群趋势指数 (I)与温度 (X)变化的回归关系分别为 SE=- 118.94 17+19.0 12 X - 0 .4 2 14X2 ;SL =- 10 7.2 795+18.0 815X - 0 .4 0 4 3X2 ;SP=- 10 6 .0 318+17.7372 X - 0 .384 5X2 ;E =- 4 5.10 2 7+455.50 0 3X - 9.350 4 X2 和 I =- 1757.318+176 .76 59X - 3.6 6 56 X2 .通过不同温度下实验种群参数的比较得出 :2 5℃时内禀增长力最大 (rm=0 .1353) ,2 1℃次之 (rm=0 .130 6 ) ,确定最适温度为 2 1- 2 5℃ .高温不利于种群的生长发育 ,在 35℃时 ,各虫态存活率及成虫产卵量急剧下降 .     

寄主植物对云南烟蚜解毒酶和靶标酶活力的影响

比较了9个烤烟品种上烟蚜解毒酶和靶标酶的活力,发现烤烟品种对烟蚜解毒酶和靶标酶活力影响显著,不同品种烤烟上烟蚜的α-NA羧酸酯酶,β-NA羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、乙酰胆碱酯酶、酸性磷酸酶均有差异.     

解毒酶对小白菜中有机磷农药降解作用的研究

采用浸泡法，研究了解毒酶对有机磷农药马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷等在小白菜降解作用。结果表明，该解毒酶对此类农药有较好的降解作用，反应时间短，降解效率高。     

温度对小地老虎发育和繁殖的影响

研究小地老虎在16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃和34℃ 7个温度下的生长发育和繁殖情况.结果表明,随着温度升高,小地老虎生长速度加快,发育历期缩短;至31℃时,卵、幼虫和蛹的生长速度开始减缓.随着温度的升高,小地老虎的雌性比例在不断的下降.在低温和高温下,小地老虎的成虫寿命会缩短.存活率和产卵量会下降,说明高温和低温对小地老虎的生长极为不利.25℃左右是小地老虎种群生长发育和繁殖的最适温度.小地老虎全世代的发育起点温度为10.74℃,有效积温为620.64日度.     

转双抗三倍体毛白杨对舞毒蛾幼虫中肠解毒酶的影响

[目的]为转基因植物的合理利用提供理论依据。[方法]以转Bt基因和慈姑蛋白酶抑制剂基因三倍体毛白杨叶片喂4～5龄舞毒蛾幼虫,对其中肠几种重要解毒酶的活性进行了测定。[结果]幼虫中肠酯酶的比活力变化是先升高后降低,24 h后达到高峰,而在48 h后,比活力明显下降;谷胱甘肽-S-转移酶的比活力是一直在升高。取食抗虫杨Pb1、Pb33和Pb47叶片48 h后的舞毒蛾幼虫中肠酯酶的比活力分别为取食CK幼虫酯酶比活力的62.9%、70.7%和74.5%;24 h后的幼虫中肠谷胱甘肽-S-转移酶的比活力分别比取食CK幼虫谷胱甘肽-S-转移酶比活力下降了25.7%、27.7%和17.9%。[结论]导致幼虫中肠解毒酶活性的改变可能是转基因叶片毒杀害虫的作用机制之一。     

穿心莲内酯衍生物对粘虫3种保护酶活力的影响

【目的】比较4种穿心莲内酯衍生物（A2、A4b、A4d、A4e）与羟基马桑毒素（Tutin）对粘虫生理代谢影响的差异,为探索新型植物源杀虫剂提供依据。【方法】粘虫3龄幼虫采用Tutin和A2、A4b、A4d、A4e经活体和离体2种方法处理后制备粗酶液,用比色法测定试虫超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）3种保护酶的活力,通过酶比活力对比分析活体处理不同时间酶活力的变化及2种处理方法酶活力水平的一致性。【结果】活体试验结果表明,Tutin、A2、A4b、A4d、A4e对粘虫体内POD、CAT活力有抑制作用,而对SOD活力有促进作用;在5种化合物中,整体而言,A4b和A4e对3种保护酶的影响较大。离体测定结果表明,粘虫体内POD、CAT和SOD活力的变化趋势与活体测定结果相似。【结论】A2、A4b、A4d、A4e和Tutin通过对粘虫幼虫3种保护酶活性的干扰,削弱了其对氧自由基和H₂O₂的解毒代谢功能,表明4种穿心莲内酯衍生物可以作为新型植物源杀虫剂。采用活体与离体2种方法对粘虫比活力的测定结果一致。     

烟碱对马铃薯块茎蛾幼虫保护酶和解毒酶的影响

为研究植食性昆虫与植物次生物质的关系,以检疫性害虫马铃薯块茎蛾[Phthorimaea operculella(Zeller)]为研究对象,连续5代用含有植物次生代谢物质烟碱的人工饲料喂养幼虫,自2龄幼虫饲养至5龄,测定烟碱对幼虫解毒酶系和保护酶系的影响。结果表明:5龄幼虫中肠内的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性显著提高,在第3代时达最大值,分别是对照的1.86倍和1.59倍;烟碱可明显抑制马铃薯块茎蛾幼虫超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,抑制随着饲养代数的增加呈先升高后降低的趋势,烟碱可显著提高马铃薯块茎蛾幼虫过氧化物酶(POD)的活性。结论:马铃薯块茎蛾在取食含有植物次生物质烟碱后能启动自身的解毒酶系统并通过调节保护酶系统,逐步适应植物毒素的危害。     

东方粘虫中肠V-ATP酶a亚基的克隆及原核表达

对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。     

转Bt基因杨树对美国白蛾幼虫中肠解毒酶及乙酰胆碱酯酶的影响

以转Bt基因欧洲黑杨叶片饲喂4-5龄美国白蛾幼虫，对其中肠几种重要解毒酶及乙酰胆碱酯酶的活性进行了测定。结果表明，中肠多功能氧化酶受到强烈抑制，饲喂4h后，多功能氧化酶的活性比对照降低50.89%，48h后，该酶活性仅为对照的1/6，酯酶及羟酸酯酶的活性也受到明显抑制，饲喂48h后，上述两种酶的活性分别比对照降低73.58%和56.55%，谷胱甘肽S-转移酶变化比较复杂，饲喂24h后其活性出现峰值；48h后与对照持平，中肠乙酰胆碱酯酶活性无明显变化，转基因叶片对幼虫中肠解毒酶活性的抑制可能是其毒杀害虫的作用机制之一。     

PuGV-Ps对甜菜夜蛾中肠液酶解δ-内毒素的影响

粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)总蛋白酶活力测定表明,PuGV-Ps在pH 7.38～10.38范围内均具有蛋白酶活性,且酶活力随pH的升高而显著提高.4种蛋白酶抑制剂均能抑制PuGV-Ps的蛋白酶活力,以大豆胰蛋白酶抑制剂的抑制作用最强,表明PuGV-Ps的蛋白酶活性是以胰蛋白酶为主要活力的多种蛋白酶的活性特征.PuGV-Ps对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠酶液离体蛋白酶活力及取食PuGV-Ps后总蛋白酶活力的影响测定表明,在中肠液酶适宜pH(9.38～10.38)范围内,PuGV-Ps在一定程度上抑制了中肠酶液的总蛋白酶活力.SDS-PAGE试验表明,PuGV-Ps影响甜菜夜蛾中肠酶液对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis) δ-内毒素的降解活化作用,表现在对130 ku的δ-内毒素酶解活化成60～87 ku的活性多肽影响不大,但对其进一步降解具有抑制作用.不同缓冲液同样影响甜菜夜蛾中肠酶液对δ-内毒素的降解,Na2CO3是影响降解程度的重要因子.     

寄主植物对云南烟蚜解毒酶和靶标酶活力的影响

比较了9个烤烟品种上烟蚜解毒酶和靶标酶的活力，发现烤烟品种对烟蚜解毒酶和靶标酶活力影响显著，不同品种烤烟上烟蚜的αNA羧酸酯酶，β－NA羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、乙酰胆碱酯酶、酸性磷酸酶均有差异。     

抗性选育对小菜蛾体内解毒酶和消化酶活性的影响

测定小菜蛾Cry1Ac抗性品系(Cry1Ac–R)、Cry1Ac敏感品系(Cry1Ac–S)3种解毒酶的活性。结果表明,小菜蛾抗性品系的谷胱甘肽转移酶活性高于敏感品系;敏感品系的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性高于抗性品系,但2品系的解毒酶活性无显著差异。测定小菜蛾Cry1Ac抗性品系、敏感品系及Bt抗性品系(Bt–T2)消化酶活性,结果小菜蛾敏感品系海藻糖酶、蔗糖酶活性均最高,Bt抗性品系最低,但各品系的2种消化酶活性之间差异不显著;小菜蛾敏感品系蛋白酶活性最高,抗性品系最低,各品系的蛋白酶活性差异极显著。     

芫花粗提物对鳞翅目幼虫消化酶和解毒酶的影响

卫矛尺蠖和菜粉蝶幼虫取食涂有芫花乙醇粗提物的叶子后，1－2d内即可使消化酶及谷胱甘肽酶活力显著上升，此后回落到对照显著低于对照水平，电镜观察表明，24h后，中肠细胞粗糙内质网上的蛋白体数量增加，着色加深，显示这些部位的功能更趋活跃，48h后，细胞内线粒体内嵴开始模糊，体积肿大72h后，部分线粒体成为空壳，以上事实为中毒昆虫的生理变化提供了亚细胞水平的依据。