柽柳硫氧还蛋白过氧化物酶(ThPrx1)基因转入酵母的抗逆能力分析

从柽柳(Tamarix hispida)中克隆到了一个硫氧还蛋白过氧化物酶(Peroxiredoxin,Prx)家族基因(ThPrx1).为了研究ThPrxl的抗逆功能,将ThPrx1基因构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,获得重组酵母,并用转空pYES...     

核桃翻译起始因子JreIF1A的克隆及抗旱功能分析

真核生物翻译起始因子(eIF1)在逆境响应中具有一定的调节功能。本研究克隆获得核桃(Juglans regia)的1条eIF1A基因(命名为JreIF1A),通过生物信息学、基因表达及酵母转化等不同技术,分析JreIF1A在干旱胁迫下的基本生物功能。结果表明,JreIF1A的开放阅读框为438 bp,编码的多肽含145个氨基酸,分子量为16 344.48 u,理论等电点为5.08。JreIF1A与土瓶草(Cephalotus follicularis)、毛果杨(Populus trichocarpa)等的亲缘关系较近。JreIF1A能被干旱胁迫显著诱导,且在根和叶中具有表达特异性。将JreIF1A转入酵母,对转基因酵母INVSC1(pYES2-JreIF1A)及对照酵母INVSC1(pYES2)分别进行干旱(山梨醇,0.2 mol/L)处理,发现INVSC1(pYES2-JreIF1A)在干旱胁迫下的生长活性显著优于INVSC1(pYES2)。表明JreIF1A基因能不同程度地响应干旱胁迫,其表达可有效改善转基因酵母的抗旱响应能力;JreIF1A基因可作为核桃逆境适应机制研究的候选基因。     

柽柳谷胱甘肽转移酶基因(ThGSTZ1)转入酵母的抗逆能力分析

[目的]研究盐、重金属、低温和高温胁迫下,柽柳GST基因（命名为ThGSTZ1）的抗性作用。[方法]将ThGSTZl基因构建到酵母表达载体pYES2中,转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）获得重组型酵母,同时以转化空载体pYES2的重组酵母作为阴性对照;对2种重组酵母分别进行LiCl、NaCl、KCI、CdCl2、ZnCl2、MgCl2、-20和53qC胁迫处理,比较2种酵母的成活率。[结果]ThGSTZ1能有效的提高酵母的抗盐碱及极端温度的能力,表明ThGSTZ1可能参与柽柳的逆境胁迫应答过程。[结论]GST基因具有参与多种胁迫响应和调节的功能。     

紫苏PfDGAT1酵母功能互补分析

[目的]本试验将已克隆的紫苏种子中高表达二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因PfDGAT1转化至酿酒酵母突变型菌株H1246进行酵母互补功能验证,研究二酰甘油酰基转移酶是否具有催化油脂合成的作用。[方法]通过构建紫苏DGAT基因的酵母表达载体pYES2.0-PfDGAT1并转化至酿酒酵母突变型菌株H1246,用尼罗红对转基因酵母细胞染色,检测转基因酵母中是否能合成油体;利用薄层层析(TLC)试验检测转基因酵母中是否存在三酰甘油(TAG)。[结果]转pYES2.0-PfDGAT1载体的突变型酵母菌株H1246能够检测到有油体存在,而转pYES2.0空载体的突变型酵母菌株H1246中没有检测到油体,说明紫苏PfDGAT1基因的表达恢复了酿酒酵母突变型菌株H1246油体缺陷的表型,可以催化TAG合成。[结论]PfDGAT1基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,该研究结果为深入解析PfDGAT1基因在紫苏油脂合成途径中的功能奠定了基础。     

油葵脂肪酸去饱和酶基因HaFAD2-1的克隆与功能鉴定

为研究油葵FAD2-1基因在脂肪酸合成中的催化功能,利用RT-PCR技术,从油葵品种新葵杂4号未成熟种子中克隆HaFAD2-1基因的全长cDNA序列。将该基因序列构建穿梭表达载体pYES2-HaFAD2-1,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中。将重组酵母诱导培养后对其总脂肪酸进行GC-MS分析。结果显示,HaFAD2-1基因编码一个长378个氨基酸的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子质量43 719,等电点(pI)为8.38,具有3个高度保守的组氨酸簇。脂肪酸甲酯气相色谱分析结果表明HaFAD2-1基因在酿酒酵母中获得表达,能将油酸转化为亚油酸,证明克隆得到的HaFAD2-1具有完整的催化功能。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

水稻cDNA酵母表达文库的构建及重金属镉胁迫相关基因的初步筛选

提取经重金属胁迫处理的水稻幼苗总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成cDNA,利用Gateway技术将cDNA构建到入门载体pDONR222后,再经LR反应重组到酵母表达载体pYES2-DEST52上,获得水稻cDNA表达文库。检测表明,所构建的cDNA文库能达到后续试验要求。使用重金属镉敏感酵母突变株ycf1Δ进行水稻中重金属镉耐受相关基因筛选,获得多个可以恢复表型的酵母单克隆。提取质粒并测序分析后可知涉及到水通道蛋白、蛋白酶抑制剂以及金属硫蛋白等不同基因,筛选所得基因即为水稻应答重金属镉胁迫的候选基因。     

葡萄芪合酶基因cDNA片段酵母表达载体的构建及其在酿酒酵母中的表达

应用基因重组技术,将从华东葡萄白河-35-1中分离出的长1179 bp芪合酶(stilbene synthase,STS)基因的cDNA片段克隆入大肠杆菌-酵母菌穿梭型诱导表达载体pYES6/CT上,构建重组酵母真核表达质粒pYES6/CT-STS,转化酿酒酵母菌株INVSc1,用Blasticidin(bsd)筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行5个时间段菌体全蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果发现,诱导4 h后开始有目标带(48 ku)出现,诱导16 h开始大量且稳定表达。证明目的基因片段可以在酿酒酵母中表达,为后续基因功能的验证奠定了基础。     

筛选GPAT基因的酵母遗传互补体系的优化

3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)是甘油脂生物合成途径中催化第1步酰化反应的关键酶,参与生物体的不同代谢途径,发挥着不同的生理功能。本研究对已构建的GPAT基因酵母遗传互补筛选体系进行优化,通过替换酵母表达载体pYES2-Kan-yADH1 v1中ADH1启动子,增强目的基因的表达;同时,在酵母遗传转化后对菌株进行复苏培养,提高遗传转化效率,增加阳性菌落数目。该体系的优化将进一步提高GPAT酶的筛选效率。     

玉米ZmPsaH基因真核表达载体的构建及转化

[目的]PsaH是光合系统Ⅰ(PSI)中的一个亚基,在植物光合系统中起着重要的作用.为研究玉米ZmPsaH基因在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmPsaH基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.利用RT-PCR技术扩增得到大小约为420 bp的玉米ZmPsaH基因,经限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒ZmPsaH-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmPsaH-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米ZmPsaH基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.     

水稻高盐胁迫下的酵母双杂交文库构建及OsRPK1胞内互作蛋白质的筛选

为了挖掘水稻OsRPK1胞内互作蛋白质,阐明OsRPK1参与高盐胁迫的分子机制,本研究利用SMART技术,构建水稻高盐胁迫下根尖的酵母双杂交文库。PCR扩增获得OsRPK1基因编码胞内区域的碱基序列,构建诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),检测诱饵表达载体在酵母中的毒性和自激活活性,筛选OsRPK1胞内互作蛋白,进一步分析高盐胁迫下候选基因的表达模式。结果表明,构建的cDNA文库库容量为1.11×10~7 CFU,文库重组率为96%,文库插入片段多态性较好。成功构建了诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),经检测诱饵表达载体无毒性,无自激活活性。诱饵表达载体与cDNA文库进行双杂交筛选,经测序和比对分析获得了11个重要的候选基因,检测候选基因在高盐处理下的表达情况,其中8个候选基因受高盐诱导表达,2个候选基因受高盐胁迫抑制表达,1个候选基因受高盐胁迫瞬时诱导表达后表达量又受到显著抑制。     

耐盐基因Hal1的克隆及表达载体的构建

以酵母菌株BWG1-7A基因组DNA为模板,利用PCR方法,扩增出耐盐基因Hal1,测序表明该基因全长为885个核苷酸,与已发表的序列NC_001148比较,同源性99．3％。将该基因插入表达载体pYES2的BamHI和EcoRI酶切位点之间。构建表达载体pYES2-Hal1,序列测定完全正确,为植物表达载体的构建打下基础。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。     

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及粟酒裂殖酵母表达载体的构建

利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

耐盐基因Hall的克隆及表达载体的构建

以酵母菌株BWGI-7A基因组DNA为模板,利用PCR方法,扩增出耐盐基因Hall,测序表明该基因全长为885个核苷酸,与已发表的序列NC_001148比较,同源性99.3%.将该基因插入表达载体pYES2的BamHl和EcoKI酶切位点之间,构建表达载体pYES2-Hall,序列测定完全正确,为植物表达载体的构建打下基础.     

来源于盐惰菌属Halopiger xanaduensis的木聚糖酶基因在毕赤酵母中诱导表达及其酶学性质的研究

根据毕赤酵母的密码子偏爱性和木聚糖酶的蛋白序列设计并合成了木聚糖酶基因片段,与表达载体pYPX88连接,构建成分泌表达载体;构建的分泌表达载体经BglⅡ酶切后电击转化到毕赤酵母GS115中,筛选得到阳性克隆。研究了重组木聚糖酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、温度稳定性以及部分金属离子、十二烷基硫酸钠(SDS)和二硫苏糖醇(DTT)对该酶性质的影响。结果表明:重组木聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4.5—8.0时酶学性质稳定;最适温度为60℃在20-65℃时酶学性质稳定;金属离子Mn~(2+)与Cu~(2+)对该酶有抑制作用,化合物DTT对该酶有明显促进作用。     

杂合抗菌肽基因的设计及表达载体的构建

为高效表达具有高抗菌活性的抗菌肽,根据Magainin 2(MA)、Sapecin(SA)和Melittin (ME)基因核心序列,设计杂合抗茵肽MA-SA-ME(MSM)基因并进行密码子优化.生物信息学分析显示,该抗茵肽具有很好的抗茵作用.将MSM基因与毕赤酵母表达载体pPICZQ-A连接,构建重组表达载体pPICZ...