猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的单克隆抗体,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)GP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和NS0浆细胞瘤细胞进行融合,经间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆化获得3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的(mAb)杂交瘤细胞株,命名为4B7、2C5和2E4。间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ 4株的Marc 145细胞特异性反应,表明其可识别天然病毒蛋白。mAb的Ig亚类均为IgG1,细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶256和1∶51 200,Western blot分析表明,mAb均特异性识别PRRSV GP5蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP_5基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆到的猪繁殖与呼吸综合征病毒全长GP5基因插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒中,再将重组质粒pAdTrack-CMV/GP5用PmeⅠ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-GP5,经酶切充分暴露反向末端重复序列,再与脂质体混合转染AD-293细胞,成功获得了AD-GP5复制缺陷型腺病毒,经检测证实AD-GP5稳定性好,安全性高.转录水平检测证实,GP5蛋白基因得到了转录;荧光检测发现,外源蛋白已得到表达.     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

[目的]对猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）的GPS蛋白进行纯化与免疫活性分析,为建立相应的血清学诊断方法奠定基础。[方法]用构建好的重组表达质粒pGEX-6P-5转化B121后经IPTG诱导表达。对表达产物进行可溶性分析,再将重组目的蛋白纯化后进行SDS—PAGE鉴定和Western—blot分析,最后用重组抗原进行豚鼠免疫试验。[结果]经层析扫描分析目的蛋白含量占菌体蛋白总量30％左右,纯化后目的蛋白纯度可迭80％。经Western—blot及豚鼠免疫试验对纯化蛋白进行分析后证明,表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。[结论]该研究为深入研究PRRSVORFs基因及其编码蛋白功能提供了材料,同时也为生产猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程产品奠定了良好基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因疫苗的构建及免疫小鼠试验

参照已公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株GP5蛋白基因序列,设计并合成1对引物,以RT-PCR方法扩增出PRRSV的GP5基因片段(603 bp)。回收目的基因片段,克隆到pMD18-T载体内构建成重组质粒pMD18T-G。经酶切鉴定、测序正确后,再回收目的基因片段,克隆到真核表达载体pIRES-neo内,经单酶切和双酶切鉴定,成功构建基因疫苗表达载体pIRES-G。免疫小鼠试验表明,2次免疫后抗体水平显著提高,但总的抗体水平体低于灭活苗。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白的结构与功能研究进展

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV引起的一种高度接触性传染病。作为一种RNA病毒,PRRSV的基因组存在广泛变异,其中以NSP2和ORF5基因变异为主。由于不同谱系毒株的ORF5有特征性的核苷酸序列,因此ORF5可用于PRRSV的分型。ORF5编码GP5蛋白,GP5蛋白含有多个表位,可与细胞受体作用,从而影响病毒的感染、复制。近年来,关于PRRSV的分子流行病学调查倾向于揭示不同毒株所特有的氨基酸突变。这些突变通常发生在GP5蛋白的信号肽编码区、非中和表位、中和表位和跨膜区。因此有研究将这些突变数据与病毒的毒力强弱、中和能力关联起来。而研究者尝试通过突变来推测GP5蛋白的构象或功能改变,从蛋白互作的结构基础层面来解释这种联系。由于GP5的三级结构并不能用传统的高分辨率冷冻电镜以及X射线晶体学方法观测,因此生物信息学方法成为相关研究的唯一选择。此外,GP5可用于基因工程疫苗的研制。综述了近年来关于GP5蛋白的生物信息学研究,并总结了GP5蛋白对病毒感染、复制、毒力、...     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

1材料与方法1．1表达菌及试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）6P-1-GP5表达质粒由该实验室保存。Novagen蛋白纯化试剂盒、硝酸纤维素膜（NC膜）均购自华美公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司;辣根酶标记兔抗猪IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他常规试剂均由国内生产。试验用豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供,体重400-500g,共8只。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体的制备与免疫学特性测定

利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB／c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株,分别命名为4C9、5D10、5F12,其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1：64～1：1024,腹水的效价为1：3200～1：10240,IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明,这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明,5D10和5F12具有病毒中和活性,中和效价分别为1：40和1：80。5D10相对亲和力大于5F12,3株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体,表明抗GP5蛋白中和性McAb制备成功。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白共表达的自杀性DNA疫苗的构建及其免疫应答

【目的】探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）自杀性DNA疫苗的免疫效果。【方法】将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游，获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。【结果】Western blot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达，并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠，首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体，首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32，同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪，二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体，直到二免后6周仍维持这种高水平的中和抗体，而且也可检测到较高的特异性细胞免疫应答。【结论】上述研究结果表明pSFV-56具有良好的免疫原性和诱发免疫动物产生较高免疫应答的能力。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5基因的遗传变异与系统进化分析

为进一步了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在国内的分子遗传进化情况,对中国大陆1996～2008年间33株PRRSV分离毒株(29株来自GenBank)的GP5序列与国外部分代表毒株进行了分析比较.结果表明,所选PRRSV中国分离毒株中有32株属于北美洲型(NA),并大致可分为2个基因亚群,1株属于欧洲型(EU).其中,自2006年在我国暴发的高致病性蓝耳病病毒(H-PRRsV)属于亚群1,且与YA株亲缘关系较近;亚群2毒株则与Ingelvac的弱毒疫苗株及其亲本株VR-2332具有较高的同源性.     

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)抗体水平检测与分析

为探讨PRRS免疫猪场和非免疫猪场抗体水平差异,采集福建各地区64个不同规模猪场血清样本1 742份,其中免疫猪场40个共1 059份血清,非免疫猪场24个共683份血清;采用美国IDEXX公司PRRS病毒抗体ELISA试剂盒进行检测,分析其抗体阳性率、CV值及S/P区间分布值.结果显示:免疫猪场抗体阳性883份,阳性...     

鄂西北地区猪蓝耳病毒抗体水平监测

[目的]了解鄂西北地区猪群高致病性蓝耳病毒免疫水平情况。[方法]于2007年4~12月对鄂西北地区(襄樊、荆门、随州和十堰地区)76家标准化猪场接种过高致病蓝耳疫苗的猪群随机采集572份血样,应用ELISA方法对该地区的猪群致病性蓝耳血清抗体水平进行监测调查。[结果]调查结果表明,在受检的572份血清中,阳性数217份,总体阳性率37.94%,其中,抗体弱阳性样本143份,占25.00%,抗体强阳性样本有74份,占12.94%。统计分析表明,在受检的76家猪场中,群体免疫合格率在75%以上的有20家,占26.32%。[结论]该调查结果表明,鄂西北地区蓝耳抗体免疫状况不容乐观,应加强对蓝耳病的积极预防,以有效地控制猪蓝耳病疫情。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析(英文)

[Objective] The purification and immunocompetence of GPS protein in porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) were analyzed in this study, which provided basis for establishing the corresponding serological method. [Method] The recombinant expression plasmid pGEX-6P-5 was transformed into BL21 and expressed after being induced with IPTG. The solubility analysis of expression products was carried out, and then the recombinant protein was purified for SDS-PAGE identification and Western-blot analysis. Finally, the recombinant antigen was used in the immune experiment of guinea pigs. [Result] The target protein content accounted for 30% of the total cells protein content according to the chromatography scanning, and the purity of target protein after purification reached 80%. The purified protein was analyzed by Western-blot and immune experiment of guinea pigs, and the results showed that the expressed protein had good reactionogenicity and immunogenicity. [Conclusion] This study provides materials for further studies on the function between PRRSV ORF5 gene and its editing protein, which also lays a foundation for porcine reproductive and respiratory syndrome virus genetic engineering products.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒兰州分离株ORF3基因的克隆及杆状病毒载体的构建

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF3序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃Lanzhou株的ORF3基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF3,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF3转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF3.成功构建了PRRSV Lanzhou株ORF3基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒对猪免疫力的影响研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)对全世界养猪业而言是一种致命的病毒性疾病。它是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重的临床疾病,并且保持终身隐性感染的能力。PRRS也使我国养猪业遭受了巨大的损失,近年来尤其是高致病蓝耳病毒的出现,已严重影响我国生猪养殖业的健康发展。对猪繁殖与呼吸综合征的免疫作用机制及防制措施进行了综述,旨在为其今后的防制提供新的思路与方案。     

猪繁殖与呼吸综合症免疫学研究

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒引起的高度传染性病毒病。笔者就呼吸综合症病毒的理化特性、生物学特征、基因组构成、病毒复制、免疫学特征以及疫苗等作一简述