2株H9N2流感病毒的分离及HA基因序列分析

为掌握近年来H9亚型禽流感的流行状况和遗传变异规律,从河南、陕西发病养殖场采集病料,用鸡胚接种法分离病毒,并用RT-PCR法对分离出的H9N2AIV的HA基因进行扩增、克隆、测序及对得到的序列进行同源性和遗传性分析。结果表明:获得了2株H9N2亚型流感病毒,这2株病毒HA基因变异程度不大,核苷酸序列和氨基酸同源性分别为97.1%和97.8%,均属于BJ/1/94分支(Y280小分支)。从分子水平分析,这2株病毒均属于低致病力的H9N2禽源流感病毒。     

一株鸭源H9亚型禽流感病毒的分离及鉴定

从发病雏鸭体内分离到1株具血凝活性病毒,并鉴定为H9亚型禽流感病毒。取发病鸭肺作为病毒分离病料,接种10日龄SPF鸡胚,死亡鸡胚尿囊液具血凝活性,且不能被已知鸡新城疫(ND)阳性血清、产蛋下降综合症EDS-76单克隆抗体、禽流感H5亚型阳性血清抑制,但能被禽流感H9亚型阳性血清抑制,血凝抑制价为211。该毒株经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定为H9N2亚型。对分离株进行的研究结果表明,该毒株为低致病力毒株,其ICPI为0.26,IVPI为0。用第三代鸡胚尿囊液原液0.5 m l静脉注射8日龄樱桃谷鸭,雏鸭死亡率达50%。     

北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

[目的]为了解2000年北京地区H9N2分离毒株的遗传特点。[方法]采用RT-PCR技术扩增了3株H9N2亚型禽流感病毒北京地区分离株的HA基因片段,并对所得序列进行分析比较。[结果]遗传演化分析表明,所分离的3个毒株的HA基因与其他中国内地和香港毒株的同源性分别为XU株84.8%（Dk/HK/Y439/97）～98%（Ck/GX17/00）,LIU株85.1%（Dk/HK/Y439/97）～99.1%（Ck/GX17/00）,BEI株90.7%（Ck/BJ/3/01）～99.1%（Ck/GX17/00）。氨基酸序列分析发现,3株病毒均为禽源低致病力毒株,226位氨基酸均为L（Leu）,更易于与人类细胞结合;HA蛋白存在7个糖基化位点。[结论]从分子水平分析,A/Chicken/Beijing/xu/00、A/Chicken/Beijing/bei/00和A/Chicken/Beijing/liu/00株属于低致病力的H9N2亚型禽源毒株。     

H9N2禽流感病毒河南分离株NS基因序列测定及进化生物信息分析

为明确河南地区鸡群中H9N2亚型AIV中非结构蛋白基因(NS)系统进化情况,对H9N2禽流感病毒河南分离毒株非结构蛋白基因(NS)进行扩增,并克隆到pGEM T载体中测序,获得NS蛋白的完整编码序列。将NS核甘酸序列与GenBank已有的参考序列作比对,结果表明,河南分离毒株的NS基因与上海F98处于同一分支;在AIV NS基因系统发育进化树中,对测得的序列进行种系发育关系研究,确定H9N2禽流感病毒河南分离毒株的进化关系。     

H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

从临床表现呼吸困难并伴有啰音、肺部和支气管黄色干酪样栓塞为特征的病鸡肝脾肺混合匀浆中分离到1株病毒（YD株）,该病毒能凝集鸡红细胞并能被AIVH9标准阳性血清抑制,对热不稳定且对热敏感;对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10^-7和10^-6,其MDT分别为78h和70h;鸡胚尿囊液毒的HA效价和EID50明显高于番鸭胚尿囊液毒;能扩增出大小约为1027bp的特异性目的片段。结果表明．该分离毒为H9亚型禽流感病毒。     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

禽流感H11N9亚型病毒东方白鹳分离株的基因特征

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成12对特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别成功扩增出分离于东方白鹳(Ciconia boyciana)的1株H11N9亚型禽流感病毒的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树。结果表明:所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为2280、2274、2151、1692、1497、1413、759、838bp核苷酸,分别编码759、757、716、563、498、470、252/97、230/121个氨基酸。该毒株HA有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点序列为PAIASR↓GLFG,无连续的多个碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。根据该毒株与参考毒株的序列比较分析结果推测,该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过互相基因交换所形成的基因重组体。     

华东地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

为了解华东地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传特点和流行规律,利用RT-PCR方法扩增华东地区2008~2013年分离的17株H9N2亚型AIV血凝素(HA)基因片段,进行序列测定和遗传进化分析,并对HA蛋白质的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型AIV HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为84.6%~99.3%和86.0%~99.5%,均属于欧亚分支。其中15株鸡源病毒属于Y280-like亚系,2株鸭源病毒属于G1-like亚系。HA裂解位点都是非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA受体结合位点149、150、191、198和234位氨基酸存在变异,尤其是234位氨基酸有14株毒株变为L,表现出人流感病毒受体结合特性。有2株毒株在145位氨基酸出现新的糖基化位点,5个毒株在218位氨基酸缺失1个糖基化位点,13个毒株在313位氨基酸增加了一个新的糖基化位点。研究结果表明华东地区近年来H9N2亚型AIV存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。     

四株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与分子特征分析

对分离自北方地区发病鸡群中的四株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行了血凝素(HA)基因的全长扩增和序列测定.将其核苷酸序列及推定的氨基酸序列与GenBank中已有的参考序列进行比较并绘制了系统进化树.结果表明基于HA基因多个不同的核苷酸区段所做的系统发育分析结果基本一致.尽管分离时间不同,但这四株AIV的HA基因同源性很高,均属于A/DK/HK/Y280/97-like病毒.四株病毒在HA裂解位点、受体结合位点以及推测的糖基化位点的氨基酸序列均与上述亚系相似,但是其中的两株病毒由于一个核苷酸的变异,缺失了HA上298～300位的一个潜在的糖基化位点.     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析

[目的]探讨2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律。[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（H9N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株HA基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分别与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株（序列号分别为AF156376,AF156377,AF156378,AF461517,AF461519．AF461521,AF461530,AY364228,AY862606,D90305）进行比较分析,并绘制进化树。[结果]4个毒株HA基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％．其中MY株和ZD株HA基因同源性和氧基酸同源忡均为最高：WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10个毒株的核苷酪和氧基酪序列同源性分别为82．6％-95．1％、83．0％-99．0％、82．7％～95．5％和81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．0％～97．1％、86．9％-97．3％,遗传进化树分析表明,H9N2的HA基因的进化树有2个大的分支,分为2个种系：欧亚种系和北美种系。欧亚种系又分为3个群系,分别以A／Quailf HongKong／G1／97（AF156378）,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Duck／HongKong／Y280／97（AF156376）为代表株,将这4个分离株与国内一些参考株、韩国代表株（AY862606）以及上述欧亚种系代表株的HA基因序列进行比较。结果表明,MY株、WD株、PG株和zD株均属于欧亚种系,并且都属于A／Duck／HongKong／Y280／97群系,与国内参考株的亲缘关系都较近,而MY株与A／ChickenfShandong／2／99（AF461521）亲缘关系最近。PG株与A／Chicken／Liaoning／2／00（AF461519）的亲缘关系最近,氨基酸同源性达到97％。ZD株与A／Chicken／Beijing／1／97（AF461530）的亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸的同源性都是最高的,分别达95．7％、97．3％。韩国株（AY862606）则属于A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）群系。总体来看,这4个分离株与国内参考株亲缘关系较近,而与韩国株（AF156377）较远。4个分离株除WD株的HA基因裂解位点为PSRSSR／GLF,MY、PG和ZD株的HA基因裂解位点均为PARSSR／GLF,WD株裂解位点附近的A变为S,也就是由丙氨酸变为丝氨酸,S也是非碱性氨基酸,因此,致病力没有变化,这4个分离株均为低致病性禽流感病毒。HA基因的几个受体位点分别为109aa,161aa,163aa,191aa,198aa,202aa,203aa,通过比较除了PG株的198aa为丙氨酸（Ala）,其他3个都为缬氨酸（Via）。编码198aa的3个碱基由GTG突变为GCG,其他参考株的198aa变异性也较大,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Quail／HongKong／G1／97（AF156378）的198aa都是谷氨酸（Glu）,还有的国内株为T。这4个分离株的其他几个受体结合位点的氨基酸都是一样的,然而,通过对10个参考株的比较发现,191aa也容易发生变异,有的变为组氨酸（His）。202aa和203aa在所有的毒株中都比较保守。[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性。但有很多因素能够影响其HA基因的变异,从而影响其致病力,这与地域因素有很大的相关性,因此,应加强地域间的防控。     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析（摘要）

[目的]了解2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,所以均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

H9N2亚型禽流感病毒的致病特性研究

将SS，KMI，KMIII3个禽流感病毒的感染性胚液分别中2周龄及5周龄的SPF鸡，观察其症状及病理变化。结果显示：1，3个毒株均可引起攻毒鸡体温升高，部分出现水样淡黄色稀粪，但不能致死攻毒鸡，表明3个毒株均为非高致病力毒株，2，攻毒鸡除胰腺充血出血外，其他器官不见明显的肉眼病理变化，但组织病理病理学的变化较为明显和一致，主要为：脑及脊髓充血出血，神经元变性坏死，胶质细胞增生；心肌在出血，组织变性坏列, 腺充血出血，组织坏死，3个毒株对5周龄SPF鸡的病理变化无明显差异，但KMI毒株对2周龄SPF鸡的病理损害稍大于SS株。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性及其流感病毒受体类型的研究

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠咽拭子病毒分离阳性率为75%（6/8）,SPF鸡咽拭子病毒分离阳性率为100%（8/8）。攻毒后14d,斑鸠H9N2亚型禽流感病毒HI抗体阳性率为80%（4/5）,SPF鸡HI抗体阳性率为100%（5/5）。对H9N2亚型禽流感病毒受体检测结果表明,斑鸠的喉头、气管上段、中段、下段上皮细胞表面存在SAα2, 3Gal和SAα2, 6Gal两种连接键型的受体。【结论】斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）易感,且斑鸠的喉头和气管上、中、下段上皮细胞表面同时存在能够与禽流感病毒结合的SAα2, 3Gal受体和与人流感病毒结合的SAα2, 6Gal受体。