哈茨木霉几丁质合酶基因ThChsC的克隆及序列分析

 【目的】克隆哈茨木霉几丁质合酶基因全序列,并对序列进行生物信息学分析。【方法】利用多聚酶链式反应（PCR）和染色体步移技术（genome walking）克隆几丁质合酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,对蛋白质的三维结构进行预测。【结果】从哈茨木霉（Trichoderma harzianum Th-33）中扩增得到几丁质合酶基因ThChsC（GenBank登录号HQ419000）,编码区（CDS）长为2 835 bp,由4个外显子和3个内含子组成,开放阅读框（ORF）长2 688 bp,编码895个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该基因与串珠状赤霉（Gibberella moniliformis,ACY08039.1）和禾生刺盘孢菌（Colletotrichum graminicola,AAL23718.1）几丁质合酶基因相似性最高,分别为80%和81%;相应的氨基酸序列同源性均为80%,系统进化分析表明,ThChsC属于III型几丁质合酶亚家族。几丁质合酶ThChsC含有1个Chitin_synth_1结构域,1个Chitin_synth_1N结构域,1个Chitin_synth_2结构域,3个跨膜结构域,不含信号肽,为膜结合蛋白。对预测的三维结构分析表明,ThChsC含有糖基转移酶的保守DHD结构域。【结论】从哈茨木霉Th-33中克隆得到几丁质合酶基因ThChsC,对该基因的深入研究有助于探索哈茨木霉几丁质合成的机制。     

哈茨木霉H-13液体发酵产几丁质酶的条件

文中以产几丁质酶的哈茨木霉H-13为实验菌株,在相同基本培养基上,采用每次同一浓度不同碳源,同一碳源不同氮源浓度;相同浓度碳源和氮源,不同pH、温度对木霉产几丁质酶能力的影响,筛选出产几丁质酶的最佳因子,提高木霉产几丁质酶发酵的效果,促进该项发酵产品的产业化。     

哈茨木霉高产几丁质酶菌株的筛选及产酶条件研究

通过氮离子注入法诱变哈茨木霉(Trichoderma harzianum)野生菌,再以透明圈法对平板培养菌进行筛选,用DNS法测定液体培养菌的酶活,从中筛选出1株产几丁质酶能力高的哈茨木霉菌株H-13,并通过单因素试验和正交试验优化该目标菌株的发酵条件.单因素试验结果表明,添加1.0%蛋白胨时产酶量最高,1.0%胶体几丁质对菌体产几丁质酶的诱导性最强,初始pH 5.5、培养96 h时产酶量较高.正交试验表明,H-13以1.0%蛋白胨为氮源、0.5%胶体几丁质为碳源,在初始pH 5.0的培养基中培养96 h时,发酵液中的几丁质酶活可达到731.69 U?mL-1,比同样条件下的野生菌株酶活力提高1倍.     

哈茨木霉UN-2β-葡聚糖酶诱导及对水稻纹枯病的抑菌防病作用

【目的】优化哈茨木霉UN-2菌株产β-葡聚糖酶的培养基组分及发酵参数,提高其产酶能力,研究β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病病原菌的拮抗作用及田间防效,阐明哈茨木霉菌株UN-2在水稻纹枯病生物防治中的应用潜力。【方法】采用单因素试验考察不同碳源、氮源和金属离子对哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶的影响,利用正交试验确定木霉菌株产β-葡聚糖酶的最适温度、pH、接种量、瓶装量、摇床转速和发酵时间,优化哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶诱导发酵条件;通过体外拮抗试验和田间防效试验研究β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病的抑菌防病作用。【结果】哈茨木霉菌株UN-2发酵产β-葡聚糖酶最佳碳源和氮源分别为麦麸和硫酸铵,金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对木霉产β-葡聚糖酶活性具有明显的促进作用。哈茨木霉UN-2菌株以10.0 g/L麦麸、0.5 g/L β-葡聚糖、4.0 g/L硫酸铵、1.5 mmol/L Ca²⁺、0.5 mmol/L Mg²⁺为培养基,在温度32℃、起始pH 6.5、接种量8 mL(10⁶      

耐福美双的哈茨木霉菌株诱导及其几丁质酶生防特性研究

用紫外线诱变与药剂驯化相结合的方法,以哈茨木霉Th-30为出发菌株诱导得到4株能在含杀菌剂福美双2.0×105μg/L的培养基上正常生长的耐受性提高近10倍变异菌株。其中变异菌株UV-4在高浓度福美双培养基能正常生长并产生具有生防功能的几丁质酶,该几丁质酶能抑制黄瓜炭疽病菌产孢能力的85.43%,抑制致病力达68.88%,并能降解该病菌菌丝的细胞壁。UV-4菌株遗传稳定,具与福美双混用协同防治蔬菜上的真菌病害的潜力。     

哈茨木霉TH-1菌株对小麦纹枯病的控制效果研究

采用平板对峙培养法测定了哈茨木霉TH-1菌株对小麦纹枯病菌的抑制作用,并就其对小麦纹枯病的控制效果进行了室内杯播试验。结果表明：哈茨木霉TH-1菌株对小麦纹枯病菌菌丝生长有较强的抑制作用,抑制率达81.3%。在一定浓度范围内,哈茨木霉TH-1菌株的抑制作用随着孢子悬浮液浓度的降低逐渐降低。哈茨木霉TH-1菌株对小麦纹枯病有一定的控制作用,其中用哈茨木霉处理48 h后接种小麦纹枯病菌的防治效果最好,防效达74.0%。     

哈茨木霉对禾谷镰孢病原菌的抑菌活性研究

用3种实验方法研究了哈茨木霉对禾谷镰孢菌的抑制效果,分别是哈茨木霉和禾谷镰孢菌在PDA培养基上的对峙培养,哈茨木霉和禾谷镰孢菌在载玻片上对峙培养,哈茨木霉发酵液的上清液对禾谷镰孢菌的抑菌圈实验,并对培养基、pH值、温度3种培养条件进行了优化。3种实验方法的结果均表明哈茨木霉对禾谷镰孢菌有较强的抑制作用,哈茨木霉适宜生长的条件为培养基PDB,pH值6.0,30℃。     

哈茨木霉浅层液体培养适宜条件的研究

通过对培养哈茨木霉的适宜温度和ｐＨ值以及不同光照时间的研究，表明２５℃为培养哈茨木霉的适宜温度，ｐＨ５．０为适宜的ｐＨ值，连续光照有助于孢子的产生。     

哈茨木霉Rac基因的克隆及特征分析

Rac基因是普遍存在于真核生物细胞中参与环境应急反应的重要基因。本文采用RT-PCR方法从哈茨木霉中成功克隆了哈茨木霉的Rac基因的eDNA,全长718bp,推测编码204个氨基酸,蛋白分子量为22.4kD。通过数据库检索等生物信息学方法分析发现哈茨木霉Rac与羊茅香柱菌相似性高达82％。与柄篮状菌相似性也达到75％。哈茨木霉Rac基因含有GTP／GDP结合和Effeetor区。Rac基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank上登录（登录号分别FJ595933和ACM24223）。     

耐三唑类杀菌剂木霉突变体TUV-13遗传稳定性的研究

应用紫外诱变和含药培养基诱导相结合的方法,获得了一株对三唑类杀菌剂有较好耐药性的哈茨木霉突变体TUV-13.分别测定该突变体继代培养的5代,10代和20代对腈菌唑耐受能力和对病原菌的拮抗性,结果表明:该突变体的抗药性可以稳定遗传,且对病原菌的拮抗性也未丧失.同时,应用RAPD分子技术分析了不同世代菌株间的相似性.     

农杆菌介导木霉几丁质酶基因转化拟南芥及其T1代对油菜菌核病抗性提高

通过根癌农杆菌介导花期喷雾，将内切几丁质酶基因导入拟南芥哥伦比亚生态型的野生型植株中，转化的种子经潮霉素抗性筛选，获得抗性幼苗11棵，转化频率为0．22％，经叶片PCR或基因组DNAPCR，扩增出外源基因ThEn42的特异性DNA片断，当代植株表现出不育、矮化和生长发育正常等不同表型。接种油菜菌核病菌(Sclerptinia sclerotiorum)后，T1代植株对病菌抗性显著提高。     

Production of chitinases with Trichoderma harzianum isolates using solid substrate fermentation

Over forty Trichoderma harzianum isolates have been screened in solid substrate fermentation (SSF) for chitinase production. Strains were isolated from Asian soil and tree bark samples. Identification was performed in Canada and Austria by classical and molecular taxonomical methods. Four SSF media were used for the screening. They contained wheat bran, crude chitin from crab shells (SIGMA) and different salt solutions for wetting of the substrate. In a five day fermentation at 30…     

哈茨木霉对辣椒生长的影响

 在田间用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)制剂处理土壤,栽培辣椒,结果表明:哈茨木霉不但对辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和尖镰孢（Fusarium oxysporum）引起的根腐病具有一定的防病作用,而且能促进植株生长,提前开花、挂果,提高产量15％左右。     

木霉菌对杂交水稻生长影响差异的研究

[目的]通过比较哈茨木霉（Trichoderma harzianum）抗药性标记菌株TUV-13和野生型菌株T2-16对水稻生长影响的差异,筛选出对水稻生长有更好促进作用的菌株,进一步推动木霉生防菌株在水稻上的应用。[方法]采用不同浓度的TUV-13和T2-16孢子悬浮液对水稻进行人工接种（浸种处理）,确定最适浸种浓度;室外盆栽试验采用常规方法测定水稻各个生长势指标。[结果]确定TUV-13和T2-16最适浸种浓度均为1×105个/ml;用此浓度的孢子悬浮液浸种均能提高种子活力,且TUV-13对水稻萌发的促进作用更显著,幼苗鲜重比经T2-16浸种处理增加4.85%,活力指数提高5.96%。盆栽试验显示,2个处理均能促进水稻植株根系和地上部分的生长,经TUV-13孢子悬浮液浸种的效果最显著。[结论]TUV-13对T优6135的生长具有更显著的促进作用,显示出TUV-13在水稻应用上的巨大潜力。     

哈茨木霉与杀菌剂对绿巨人褐腐病菌的抑制作用

哈茨木霉菌株和杀菌剂对绿巨人褐腐病病原菌的室内毒力测定结果表明,T5菌株的抑制效果最好,抑菌率为50.92%;爱苗对绿巨人褐腐病菌的抑制率最高,为73.03%,其次为多菌灵59.08%。多菌灵与木霉T5联合抑菌结果显示,抑菌作用随着多菌灵的浓度升高而明显增强,多菌灵浓度为75、150、300μg/mL时的抑菌率分别为41.71%、68.00%和82.86%。     

哈茨木霉TH-1处理土壤对辣椒生长的影响

研究哈茨木霉TH-1处理土壤对辣椒的促生长作用及其机制.结果表明,含哈茨木霉TH-1的处理中,辣椒的长势明显优于未含哈茨木霉TH-1处理;相对不含哈茨木霉TH-1的处理来说,舍哈茨木霉TH-1的处理中辣椒的鲜重及叶绿素的含量均显著增加,增加幅度均在22.26%以上;辣椒叶片的硝酸还原酶活性也显著提高,提高幅度高达68.12%;含哈茨木霉TH-1的未灭茵土中辣椒的长势明显优于含哈茨木霉TH-1灭菌土壤中的辣椒的长势.同时,相对含哈茨木霉TH-1灭茵土,含哈茨木霉TH-1的未灭菌土中辣椒的鲜重、叶绿素的含量及硝酸还原酶的活性显著提高,分别增加了18.42%、15.9%和26.28%.土壤中施加哈茨木霉TH-1后,放线茵、乳酸杆菌和光合细菌数量分别增加64.71%、77.27%和58.62%,酵母的数量降低了52.94%.     

紫外光诱导哈茨木霉产生对多菌灵抗药性的菌株

在含多菌灵药物培养基上,采用紫外光重复诱导处理的方法,对拮抗性哈茨木霉T24进行改良,选育出对多菌灵具有显著耐药性的菌株T24—4和T24—6。结果表明,多菌灵浓度为300mg·L^-1时,对突变菌株T24—4和T24—6的抑制率分别为9．4％和3．0％。同时两菌株对速克灵和甲基托布津也有交互抗性。经过菌和药协同作用研究发现：木霉菌T24—6菌剂与多菌灵重量配比为8：2时,协同抑菌率高达85．0％,明显高于分别单独使用T24—6和多菌灵的抑菌率（70．3％和69．6％）。分别用菌和药,药,菌1000倍稀释液进行草莓活体拮抗性测定,其对草莓灰霉病的防治效果分别为83．9％、67．9％和64．2％,进一步表明菌和药协同作用效果优势更明显。在使用木霉T24—6菌剂防治农作物病害时,添加少量的多菌灵,可降低植物病原菌的活性和侵染力,从而提高生防效果。