猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用

基于猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的序列特点，设计合成种特异性引物，建立了猪附红细胞体PCR检测方法。该方法能特异性扩增523bp的猪附红细胞体16SrRNA基因片段，而对猪丹毒杆菌G4T10株、猪链球菌STl71株、多杀性巴氏杆菌E0630株、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、鸡毒支原体和猫血巴尔通氏体CA株的基因组DNA没有扩增带出现。对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为160pg。通过对38份临床样品的检测，8份为猪附红细胞体感染阳性，其余为阴性。结果表明，建立的PCR检测方法具有极高的敏感性和特异性，可用于急性猪附红细胞体病和临床健康带菌猪的诊断。     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原，用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗．建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA)检测方法。结果显示，用PPA-ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体，具有很高的敏感性和特异性，重复性良好．完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。     

单克隆抗体间接免疫荧光(IFA)检测猪附红细胞体

为建立利用单克隆抗体检测猪附红细胞体病的间接免疫荧光(IFA)方法,用抗猪附红细胞体的单克隆抗体,对48份疑似猪附红细胞体感染的病猪猪血进行免疫荧光检测,并与血涂片镜检及PCR检测方法进行比较,结果显示IFA检测的阳性率为68.75%,与PCR检测阳性率为77.08%符合率较高,比血涂片的瑞氏和姬姆萨染色镜检阳性率高出近30个百分点;而用猪肺炎支原体、猪链球菌和猪巴氏杆菌作对照,结果均呈阴性。建立的用抗猪附红细胞体的单克隆抗体检测猪附红细胞体病的IFA特异性强,敏感性高;检测临床样品的结果准确可靠。     

猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式PCR方法明显优于血涂片染色镜检法及常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。     

将乐县猪附红细胞体病流行情况调查

将血涂片用姬姆萨染色、镜检,确认猪附红细胞体阳性感染,调查将乐县猪附红细胞体病流行情况。调查发现将乐县猪附红细胞体阳性感染率夏季比冬季更高,而且有逐年上升的趋势。     

猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法的研究

以猪附红细胞体和多种血营养菌16S rRNA基因的保守区设计合成引物HM-f/HM-r,在反向引物的5′端用生物素标记,以猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的可变区序列设计种特异性寡核苷酸探针,探针的5′端用地高辛标记,成功地建立了猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法。通过测定不同浓度PCR产物对应的微孔板杂交-酶反应显色OD值,用SPSS统计软件进行回归分析,得到回归方程为y=2.1012-0.4492×logx,其相关系数R为0.977,显示对未知样品可进行定量检测。该方法与猪的多种细菌性病原、猫血巴尔通氏体CA株和E.wenyonii无交叉反应,其敏感性比常规PCR琼脂糖电泳检测提高了近100倍。用建立的方法对38份临床样品进行检测,结果有12份检测结果为阳性。     

应用间接ELISA方法检测猪附红细胞体抗体

近年来,国内外对附红细胞体病的研究已取得一定进展,针对此病的血清学诊断先后建立了CFT、IHA、ELISA、IFAT等检测方法,这些血清学诊断方法所用抗原均为附红细胞体的粗提抗原。而本试验对猪附红细胞体抗原进行了提纯,并进行了免疫性分析,用具有最好免疫性的提纯抗原建立了检测猪附红细胞体抗体间接ELISA方法,并与IHA进行了比较,旨在为猪附红细胞体病的流行病学调查及疫病监测提供简便、快速、特异、敏感的检测方法。1材料与方法1.1主要材料96孔酶标板为MaxiSorp公司产品;羊抗猪IgG-HRP为美国KPL公司产品;猪肺炎支原体、猪瘟、…     

猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基，同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体，进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明，以RPMI1640与小牛血清按6：4比例混合，同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳，接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后24h生长达到高峰，感染率分别为40．2％和31．0％，而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

猪附红细胞体Dot-ELISA检测方法的建立

本试验建立了一种检测猪附红细胞体抗体的Dot—ELISA方法，并确定了试验程序中最适抗原包被浓度、被检血清最适稀释度等工作条件。特异性和重复性试验结果表明，所建立的Dot—ELISA不与猪瘟等常见猪病阳性血清发生交叉反应，且稳定性高；用所建立的Dot—ELISA与IHA对70头份被检血清进行平行检测，阳性率分别为90％和60％；对20份阳性血清进行检测，Dot—ELISA和IHA平均抗体滴度分别为1：1012和1：160。表明所建立的Dot-ELISA是一种比较敏感、特异和稳定的血清学检测方法，能用于猪附红细胞体的抗体检测和疾病诊断。     

一例猪附红细胞体病的实验室诊断

为确定贵州省长顺县某养殖场猪群突然发病死亡的原因,无菌采集5头发病猪的血液作为检测病料,采用细菌分离培养、病毒核酸检测和血涂片检查3种方法进行实验室诊断。结果:细菌分离培养和病毒核酸检测均为阴性;血涂片姬姆萨染色镜检显示大部分红细胞边缘不整齐,呈星芒状、锯齿状、刺球状等不规则形状,符合附红细胞体感染特征。结论:猪群发病原因为附红细胞体感染。     

兔抗猪附红细胞体阳性血清的制备研究

猪附红细胞体寄生于红细胞表面或游离于血浆、组织液及脑脊液中,引起猪发热、溶血性贫血和黄疽等主要症状。本试验用猪附红细胞体抗原和弗氏佐剂乳化制备免疫原,免疫试验兔,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清的效价,当测得血清的OD值与阴性对照组的血清值之比(P/N)分别为8.02(P/N﹥2.1)、7.16(P/N﹥2.1),采集兔血分离阳性血清。本试验为进一步研究猪附红细胞体的粘附阻抑以及该病的诊断、治疗提供了试验材料,并探索出了兔抗猪附红细胞体阳性血清的制备方法。     

猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪附红细胞体混合感染病例的实验室诊断

为确诊贵州省兴义市某养殖场生猪的发病原因,分别采集病死猪组织样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒核酸检测,以及病猪耳静脉血进行血液原虫检查.结果:(1)实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒核酸和PCR检测猪圆环病毒2型核酸均为阳性.其余病毒核酸检测均为阴性.(2)血涂片姬姆萨染色观察...     

猪附红细胞体病的诊断与治疗

猪附红细胞体病是由立克次氏体病原-猪附红细胞体引起的以贫血、黄疸和发热为主要症状的人畜共患病,该病多为阴性感染,造成家畜的体质下降,生长速度减慢,饲料报酬降低。采用鲜血涂片镜检,血片染色镜检、动物实验和间接血球凝集实验等方法对70日龄的发病猪进行诊断,用血虫清+土霉素制剂、维生素C、维生素B12和肌苷治疗,效果明显。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了1对引物，分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板，采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，确定特异性产物的Tm值，同时做普通PCR。试验结果表明，特异性产物的Tm值为88．5℃，最低能检测到含0．036fg／μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性，为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

单抗捕捉ELISA检测猪附红细胞体血清抗体方法的建立

在制备针对猪附红细胞体病的特异性单克隆抗体的基础上,建立了单抗捕捉快速检测猪附红细胞体病抗体的ELISA方法,并对影响ELISA结果的各项反应条件进行了优化.结果表明,猪附红细胞体腹水单抗的最佳稀释度为1:20 000,猪附红细胞体病抗原工作质量浓度为4.088 mg/L,血清稀释度为1:40,HRP标记的兔抗猪IgG的工作浓度为1:5 000.待检血清和酶标二抗的反应时间均为37℃1 h;底物在室温显色时间为10 min.已建立的ELISA方法与PCR平行检测50份样本,总符合率为92%,表明该方法特异性强、快速、敏感性高.用该法检测了各地采集的171份血清,阳性率为40.4%,与镜检的符合率为59.2%;阴性率为47.4%,与镜检的符合率为66.7%,总符合率为67.3%.     

猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较.结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868 bp(GenBank登录号为;JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99％,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断.     

猪附红细胞体阳性血清的制备研究

猪附红细胞体寄生于红细胞表面或游离于血浆、组织液及脑脊液中,引起猪发热、溶血性贫血和黄疽等主要症状。本试验用猪附红细胞体抗原和弗氏佐剂乳化制备免疫原,免疫健康仔猪,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清的效价,当测得免疫猪血清的OD值与阴性对照猪的血清值之比(P/N)为8.16(P/N2.1),采集免疫猪血分离阳性血清,本试验探索出了猪附红细胞体阳性血清的制备方法。     

猪附红细胞体病流行病学调查及诊治

通过对广东、海南、江西等地110个猪场送检的2450份血液的检测，结果发现猪附红细胞体病阳性场为102个，阳性率为92．7％，结合生产实际对猪附红细胞体病的流行病学和诊治方法进行阐述。     

猪附红细胞体病流行病学调查及不同药物治疗效果

对保定市猪附红细胞体病进行流行病学调查,并对感染附红体断奶仔猪进行药物治疗试验.选择保定市6个县区30个不同规模的猪场和20个散养户,随机采集不同年龄阶段猪血液样品2 040份,进行直接压片镜检、血液涂片染色镜检和碘制动试验等病原学检测;选择阳性断奶仔猪进行药物治疗试验.结果保定市猪附红细胞体感染率为74.25％,不同年龄阶段的猪不同季节均可感染附红细胞体;临床治疗及体外药敏试验结果表明,贝尼尔、咪唑苯脲、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶和土霉素对断奶仔猪附红细胞病的治疗具有较好的效果,尤以盐酸多西环素效果最佳.     

猪附红细胞体病感染情况调查

采用镜检法检测屠宰生猪附红细胞体感染情况，共检测血样３９７份，检出阳性血３７１份，感染率为９３．４５％，说明猪附红细胞体感染率极高。同时，抽查３头母猪及其新生仔猪各５头，采用耳尖采血调查垂传播，结果２头猪所产５头仔猪所产５头仔猪均检出附红细胞体，１头未感染附红细胞体的母猪所产５头仔猪也未发现附红细胞体，这对生趣传播提供了有国和的证据。