9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因克隆及蛋白序列分析

[目的]克隆绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因,比对、分析不同菌株P113蛋白序列,为研究绵羊肺炎支原体P113蛋白的生物学功能提供参考。[方法]设计绵羊肺炎支原体P113基因特异性引物,采用PCR方法扩增9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株的P113基因片段;对获得的9株绵羊肺炎支原体P113基因片段进行测序分析,将DNA序列翻译为氨基酸序列,对不同菌株的P113氨基酸序列进行比对。[结果]不同分离株P113基因片段扩增产物大小不同。氨基酸序列分析显示,C末端序列重复区域长度存在差异,以KKAEGA（S）QNQG为主要重复序列单元。不同菌株重复序列单元数量不同,NM01-MO株和CK-MO株的重复序列单元数量最多,为16个;LK-MO株重复序列单元数量最少,为3个;多数菌株之间重复序列单元数量差异较大。[结论]绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113氨基酸序列的C末端重复序列单元数量不同,这些不同数量的重复序列影响P113蛋白结构,进而可能影响其生物学功能。     

绵羊肺炎支原体NM2010株P60基因的生物信息学分析及原核表达

为了探讨绵羊肺炎支原体NM2010株假定P60样脂蛋白用于制备基因工程亚单位疫苗的可能性,试验运用ExPASy、SignalP 4.0、TMHMM 2.0、SOPMA、 PSORT 6.4、IEDB、BlastP、Hcluster_sg、Muscle等生物信息学软件,对绵羊肺炎支原体NM2010株P60基因编码蛋白的理化性质、跨膜区、信号肽、二级结构、亚细胞定位、B细胞抗原表位、蛋白功能和基因家族进行预测分析。利用人工合成方法获得P60成熟肽编码区基因序列,并克隆到表达载体pET-32a(+)上进行原核表达及Western-blot分析。结果表明:绵羊肺炎支原体NM2010株P60基因编码蛋白的二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主,其结构稳定,可溶性较高;该编码蛋白有信号肽,亚细胞定位在外膜,可能是一种外膜蛋白,具有较好的抗原性;参与绵羊肺炎支原体烟酸和烟酰胺代谢途径,与绵羊肺炎支原体SC01株的GL000100(WP_010321430.1)、猪肺炎支原体7448株的0353(WP_011290189)属于同一家族,均为P60样脂蛋白。P60基因序列中的TGA成功突变为同义密码子TGG,重组蛋白的分子质量为74.0 ku,以可溶形式存在,具有良好的反应原性。说明P60重组蛋白可以作为绵羊支原体性肺炎基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。     

猪肺炎支原体P216基因片段的表达及黏附活性研究

本研究旨在研究猪肺炎支原体P216蛋白的黏附活性并初步建立猪肺炎支原体蛋白黏附模型。根据软件分析和文献报道从P216全基因中选取亲水性、抗原性、黏附性较好的目的片段,利用PCR从Mhp NJ株扩增P216基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a(+)/P216,经IPTG诱导获得重组蛋白,通过Western blot和间接免疫荧光试验检测重组蛋白的免疫原性及黏附活性。结果表明,PCR扩增的目的基因大小为l 636bp;SDS-PAGE检测重组蛋白相对分子质量为80.1ku;Western blot检测表明重组蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验表明该蛋白对猪肺炎支原体黏附SJPL细胞产生占位抑制作用。结果提示,P216蛋白具有良好的黏附活性,能黏附SJPL细胞,从而为猪肺炎支原体其他黏附因子的研究奠定基础。     

绵羊肺炎支原体p128基因序列分析及原核表达

为进一步探究绵羊肺炎支原体P128蛋白的相关功能,在进行生物信息学分析的基础上,对编码p128的部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blot方法对其免疫原性进行了分析。结果显示,p128基因与猪肺炎支原体黏附素基因p146高度同源;克隆基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在;经纯化的重组蛋白与抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P128蛋白是良好的免疫原。研究结果为进一步分析其功能及绵羊肺炎支原体血清学诊断技术的建立提供了有用的信息。     

绵羊肺炎支原体P113蛋白N端原核表达及其抗原性分析

绵羊肺炎支原体可感染绵羊及山羊,并导致非典型肺炎的发生.P113蛋白是绵羊肺炎支原体推测的粘附素,为进一步研究P113蛋白的功能,本试验对其N端1～231位氨基酸的片段进行了原核表达,并采用Western b1ot方法对P113蛋白免疫原性进行了分析.结果显示,重组蛋白以包涵体的形式在Rosetta(DE3)工程菌中成功获得表达;经纯化的重组蛋白与抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生特异性结合反应,表明P113蛋白是良好的免疫原.     

丝状支原体丝状亚种SC型LppC基因的表达纯化

丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PGI的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32a为载体构建重组质粒进行诱导表达。LppCN末端基因长度为644bp,将其与NCBI上发布的Afade株、欧洲群代表株L2比较,它的核酸序列同源性为100％,表明LppC基因在种内高度保守。原核表达结果得到大小为45ku的目的蛋白,用Ni-NTA系统进行纯化得到高纯度的蛋白。Westernblot结果表明,重组蛋白能与牛传染性胸膜肺炎阳性血清反应,具有免疫学活性,为进一步与LppQ融合表达奠定基础。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。     

绵羊肺炎支原体P110/LppT黏附素家族保守区的原核表达和免疫原性分析

绵羊肺炎支原体(Mo) NM2010株的P120蛋白与猪肺炎支原体(Mhp)的黏附素P110高度同源，同属于P110/LppT黏附素N端结构域家族。为了筛选用于研制广谱绵羊支原体肺炎疫苗的保护性抗原，本试验利用生物信息学方法对Mo NM2010株P120蛋白的保守区段、结构、B细胞抗原表位进行预测分析，并对P120基因的N端和C端2个保守区基因片段进行克隆、表达、可溶性分析和抗原特性分析；2个表达产物分别对兔进行免疫试验，用ELISA方法检测免疫兔血清抗体效价和IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子浓度。结果显示，P120蛋白N端有信号肽和1个跨膜螺旋，亚细胞定位在外膜，可能是一种外膜蛋白，P120蛋白N端和C端2个保守区段均有较多B细胞线性抗原表位，具有较好的抗原性；经序列测定证实，合成的P120-N和P120-C 2个基因片段的基因序列完全正确，长度分别为1 509 bp和741 bp,表达的重组蛋白分子质量分别为58.1 kDa和29.5 kDa; P120蛋白N端以可溶和包涵体2种形式存在，C端以包涵体形式存在，均具有良好的抗原性；新西兰大白兔经4次免疫后，重组蛋白...     

绵羊肺炎支原体P109'蛋白的分子特征及抗原性分析

为了研究绵羊肺炎支原体P109'蛋白分子结构特征与抗原性,本研究对p109'基因经生物信息学分析,通过PCR对其部分基因片段进行扩增,将其克隆至p ET-32a(+)以构建原核表达载体,诱导后经大肠杆菌表达体系进行原核表达,并通过Western-blot分析该蛋白的反应原性。结果表明p109'基因与殊异支原体编码假定蛋白基因MDIS-01350、猪肺炎支原体黏附相关基因p102及编码P102样蛋白基因mhp217之间具有较高的同源性。重组P109'蛋白以包涵体形式在大肠杆菌BL21(DE3)中成功得到表达;经纯化后的重组蛋白与山羊抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P109'蛋白具有良好的反应原性,为后期建立绵羊肺炎支原体特异快速诊断技术奠定基础。     

绵羊肺炎支原体标准株Y98与丝状支原体丝标准株PG3、绵羊肺炎支原体分离株HD-1、标准株FH抗原的差异性研究

试验采用SDS—PAGE和免疫印迹分析技术研究了绵羊肺炎支原体标准株Y98与绵羊肺炎支原体分离株HD-1、丝状支原体丝状亚种PG3以及肺炎支原体标准株FH间细胞膜蛋白免疫原性的异同。结果表明：绵羊肺炎支原体标准株Y98同绵羊肺炎支原体分离株HD-1间细胞膜蛋白免疫印迹结果基本一致,而绵羊肺炎支原体标准株Y98与丝状支原体丝状亚种PG3和肺炎支原体标准株FH抗原差异较大,缺乏共同抗原成分。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

瑶山亚种树鼩ISG15蛋白表达及其多克隆抗体制备

[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。     

P[1]型A群牛轮状病毒VP8重组蛋白的表达与免疫原性研究

【目的】 利用原核表达系统表达P[1]型A群牛轮状病毒(BRVA) VP8重组蛋白,并评价其反应原性与免疫原性。【方法】 根据国内流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1] VP8基因序列(GenBank登录号:MN937517)进行密码子偏好性优化,构建P[1]型BRVA VP8大肠杆菌原核表达系统,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,Western blotting鉴定重组蛋白与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合能力,并将P[1]型BRVA VP8重组蛋白免疫兔,首免后2周加强免疫1次,共免疫2次。分别用间接ELISA方法与中和试验评价其免疫原性。【结果】 本研究成功构建P[1]型BRVA VP8重组蛋白的原核表达系统;SDS-PAGE结果显示,高效表达大小为20 ku的P[1]型BRVA VP8重组蛋白,以可溶形式存在;Western blotting结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白能与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合;间接ELISA结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白亚单位疫苗能诱导兔产生抗体,兔首免1周后抗体开始出现并迅速上升,于第3周达到高峰,至第5周仍维持在较高水平;中和试验结果显示,第2次免疫后抗体最高的兔血清对G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效价分别为1∶17 783和1∶64。【结论】 本研究成功构建原核表达系统表达P[1]型BRVA VP8重组蛋白,并证实其具有良好的反应原性及免疫原性,为研制BRVA亚单位疫苗奠定基础。     

猪唾液酸黏附素氨基端结构域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备

本试验旨在克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体。试验中应用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-Sn150,成功表达了分子质量大小约为43.1 ku的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白pET-Sn150免疫小鼠,制备获得鼠抗pET-Sn150重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接 ELISA 和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-Sn150多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。本试验克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因并成功表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性

用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因（COE基因）,通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体plRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和westernblot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB／c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP—COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。     

单增李斯特氏菌ActA的原核表达与纯化

PCR扩增单增李斯特氏菌ActA基因,纯化后克隆到pMD 18T simple vector 中,以BamHI和EcoRI双酶切克隆载体pMD-18T/ActA,再将其亚克隆到表达载体pGEX-3X中,获得重组质粒 pGEX-3X/ActA,转化E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导融合蛋白(GST-ActA)表达,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应.试验采用Glutathione Sepharose 4B亲合层析纯化融合蛋白.对单增李斯特氏菌ActA的原垓表达与纯化的研究为单增李斯特氏菌诊断试剂的研制及Acth的免疫原性研究奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP4蛋白免疫活性研究

克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的ORF4基因,将疏水序列缺失后,再克隆到原核表达载体pET-32a中,得到阳性重组质粒,经IPTG诱导,纯化后由Western blotting分析,并将所得的包涵体、变性蛋白和复性蛋白分别免疫小鼠,获取的血清抗体进行效价和中和活性的检测。为深入研究GP4蛋白的免疫特征奠定了基础。     

重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法及免疫原性研究

[目的]探索重组布鲁菌Omp19蛋白的制备方法,评价其在实验动物中的免疫原性,为中试工艺放大奠定基础。[方法]利用摇瓶培养对重组Omp19蛋白进行原核诱导表达,对培养基类型、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间、诱导时的菌体密度等条件进行筛选;利用阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析对重组Omp19蛋白进行纯化制备;利用SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）对重组Omp19蛋白的纯度进行鉴定;利用动物实验评价制备的重组Omp19蛋白的免疫原性。[结果]摇瓶培养试验表明,重组布鲁菌Omp19蛋白较优的表达条件为：使用LB培养基,在菌密度OD_{600 nm}值为0.6~1.0时加入0.5 mmol/L的IPTG,于28 ℃诱导5 h;经3步纯化后,获得了高纯度的重组Omp19蛋白;免疫原性研究表明,经方法优化后制备的重组Omp19蛋白联合佐剂可以较好地刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体。[结论]优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法,评价了其在小鼠中的免疫原性,为重组布鲁菌疫苗的研发提供了实验基础。     

嗜水气单胞菌溶血素A表达、免疫原性及活性检测

根据已发表的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）溶血素A基因序列设计一对特异性引物,以TPS30菌株基因组为模板,通过PCR扩增溶血素A基因,经T-A克隆、序列测定和分析,结果表明,该基因包含1482 bp碱基,编码494个氨基酸。将溶血素A定向克隆至表达载体pET32a（＋）中,构建重组表达质粒pET-THA,在IPTG诱导下成功获得重组表达蛋白His-GroEL,大小为68 kDa。对该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达特性分析表明,最佳的诱导表达条件为：在0.1 mmol/L的IPTG浓度下,21℃诱导表达3 h。表达的溶血素A蛋白纯化后免疫小鼠,经Western blot检测,表明该蛋白具有免疫原性。对纯化的溶血素A蛋白复性后,进行溶血实验,结果表明该蛋白具有溶血活性。通过本实验的研究,为进一步研究嗜水气单胞菌溶血素的生物学功能奠定了基础。