牛 TRAF6基因编码区的克隆及序列分析

为了探讨牛 TRAF6基因的结构与功能、采用基因克隆技术分离了牛 TRAF6基因的编码区序列、并采用 生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的序列特征、结构和功能。结果表明院分离了 TRAF6 基因 1 803 bp 的 cDNA 序列（GenBank 登录号为 DQ471669）、编码区长度为 1 629 bp、编码 542 个氨基酸（GenBank 登录号 为 ABF06558）、位于细胞核、细胞质、线粒体、内质网等多种细胞器上、分子量为 61. 57176 ku、等电点为 6. 09、含有 RI NG-f i nger 、zf -TRAF 和 M ATH_TRAF6结构域。 该蛋白与人、小鼠和大鼠 TRAF6蛋白的同源性分别为 89% 、84% 和 82% 、 其结构域的同源性均达到 95% 以上。 根据各物种间 TRAF6 蛋白的高同源性、 结合人和小鼠 TRAF6 蛋白在 TNF/ TLRs/ TI R 超家族介导的信号转导途径中的重要作用、推测牛 TRAF6 蛋白也可能参与调节多种信号通路、在免 疫反应、炎症反应、细胞分化和凋亡等生物学过程中发挥重要功能。     

鸡TRAF6和TIFA基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】分析肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）及具有叉头相关结构域的TRAF相互作用蛋白（TIFA）基因在贵州黄鸡不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展TRAF6和TIFA基因调控鸡的生长发育及二者相互作用调控鸡相关病毒复制打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增鸡TRAF6和TIFA基因编码区（CDS）序列,通过ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL及MegAlign等在线软件进行生物信息学分析;同时采用实时荧光定量PCR分别检测TRAF6和TIFA基因在鸡胚发育第14 d （E14d）、鸡出壳第1 d （H1d）、第7 d （H7d）和第14 d （H14d）不同组织中的表达情况。【结果】鸡TRAF6和TIFA基因CDS序列全长分别为1638和564 bp,编码545和187个氨基酸残基,对应的编码蛋白分子量约62和22 kD,理论等电点（pI）为6.14和5.18。鸡TRAF6蛋白二级结构中无规则卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸链占11.86%、β-转角占2.92%,鸡TIFA蛋白二级结构中无规则卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸链占16.58%、β-转角占3.74%,二者均以无规则卷曲和α-螺旋为主。TRAF6和TIFA基因核苷酸序列同源比对分析均显示鸡与火鸡的相似性最高,分别为96.4%和92.2%,符合物种进化规律,也表明TRAF6和TIFA基因在禽类中具有一定的遗传保守性。TRAF6和TIFA基因在贵州黄鸡不同发育阶段的眼球、脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肌胃、胸肌及腿肌中均有不同程度表达,且内脏组织的相对表达量普遍高于肌肉组织,以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和肌胃;从E14d发育到H14d,鸡TRAF6和TIFA基因在肺脏、肝脏和肌胃中的表达均呈先下降后上升的变化趋势,在眼球中则呈先上升后下降再上升的变化趋势,在脑组织、胸肌和腿肌的表达水平较低且趋于稳定。【结论】 TRAF6和TIFA基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达,且以肺脏和肝脏中的表达水平相对较高,在脑组织、胸肌和腿肌中的表达相对较低,故推测TRAF6和TIFA基因相互作用对鸡的生长发育具有调控作用。     

贵州地方白羽鸡种MSTN基因SNP位点快速筛查及其蛋白功能预测

[目的]明确贵州地方白羽鸡种肌肉生长抑制素(MSTN)基因的多态性,筛选出改良白羽鸡肉质品质的分子遗传标记,为选择培育优良肉质鸡种提供参考依据.[方法]以兴义矮脚鸡白羽品系、罗曼蛋鸡及兴义矮脚鸡白羽品系与罗曼蛋鸡杂交的自交后代(F2)为研究对象,提取3个鸡种的血液基因组DNA构建DNA混合池,PCR扩增MSTN基因全部外显子序列,直接测序筛选SNP位点并进行生物信息学分析,探究SNP位点突变对MSTN基因mRNA二级结构及编码蛋白结构和功能的影响.[结果]在鸡MSTN基因第1外显子(Exon-1)筛查到6个SNPs位点,分别为G51A、A60G、G195C、A234G、C297T和C324T,且6个SNPs位点均为同义突变.在A234G位点处检测到兴义矮脚鸡白羽系和F2代存在多态性,但罗曼蛋鸡未发生变异;在C297T位点处检测到罗曼蛋鸡存在多态性,以C为优势等位基因,而兴义矮脚鸡白羽品系和F2代均未发生变异;G51A、G60A、G159C和C324T等4个SNPs位点在3个鸡种中均存在多态性.A234G位点突变对鸡MSTN基因mRNA二级结构稳定性无影响,G51A位点突变致使MSTN基因mRNA二级结构最小自由能降低但未改变其构象,A60G、G195C、C297T和C324T等4个SNPs位点突变均引起MSTN基因mRNA二级结构和最小自由能的改变.鸡MSTN基因编码蛋白为不稳定的脂溶性蛋白,存在信号肽,但不存在跨膜区域,其二级结构由无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋组成,且以无规则卷曲占比最高.[结论]MSTN基因在贵州地方白羽鸡种中的多态性较丰富,其中A60G、G195C、C297T和C324T等4个SNPs位点突变会导致基因mRNA二级结构的构象发生改变,可作为改良白羽鸡肉质品质的分子遗传标记进一步研究.     

部分鸡种Brd2基因SNP和INDEL分析

Brd2(bromodomain containing protein 2)基因位于MHC(major histocompatibility complex)基因家族中,探究不同鸡种Brd2基因的SNP和Indel位点具有重要意义。试验选取我国26个优良的地方鸡种,对Brd2基因进行目标捕获测序,以NCBI中原鸡(Gallus gallus)的Brd2基因序列为参照,筛选出Brd2基因外显子和内含子中的SNP和Indel以及氨基酸的改变位点,最后制作进化树。在26个鸡种中,Brd2基因的外显子筛选出25个SNP位点,没有检测到Indel位点;内含子筛选出30个Indel位点,没有筛选出SNP位点;外显子中氨基酸仅有4个发生错义突变,其余均发生同义突变。从进化树看出,26个鸡种分为3大类:安卡鸡、雪山草鸡、文昌鸡、北京油鸡和萧山鸡类聚在一起;泰和乌骨鸡、SPF-来航鸡、河南斗鸡和广西黄鸡类聚在一起;剩余的鸡种类聚在一起,但同源性相对较低。在我国优质鸡种中Brd2基因具有一定的保守性,不同鸡种同源性较低。     

运用SNP-CAPS分子标记定位香菇重要功能基因的研究

根据香菇单核菌丝体135A和135B的全基因组测序,通过生物信息学方法分析筛选出香菇功能基因CAP、GLA1、TLG1结构域中的非同义SNP位点,开发出3对SNP-CAPS分子标记。结果表明:这3对功能基因SNP-CAPS分子标记可将23个香菇单核体供试菌株分成135A型(分别为16株、20株、2株)和135B型(分别为7株、3株、21株),这些标记表现出的多态性为进一步研究香菇菌株的来源和功能基因的定位提供参考价值;并建立起可以简单、快速、准确地调查重要功能基因的SNP位点变异情况的方法。     

鸡白介素-6(ChIL-6)基因的克隆与序列分析

分别用鸡传染性法氏囊病病毒感染和用ConA免疫刺激健康鸡，无菌取处理鸡的脾脏，匀浆后用Tr-izol抽提细胞总RAN，应用随机引物反转录获得cDNA，设计引物，经PCR扩增获得鸡白介素-6（ChIL-6)基因，应用pGEM-T载体克隆该基因，经测序，表明其与Gene Bank中公布的唯一的一个ChIL-6基因为同源基因。     

宁都黄鸡 GH 基因 SNP 与鸡冠性状的关联分析

【目的】研究宁都黄鸡 GH 基因（Growth hormone,GH）5''- 侧翼和内含子 1 区域单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）与鸡冠性状的关联性,以期筛选地方鸡种鸡冠性状的早期选育分子标记。【方法】以 499 只宁都黄鸡公鸡为研究对象,测定 7 个不同周龄的冠高、冠长、冠厚、肉垂长、肉垂厚以及冠齿数指标,利用 SAS（Statistical analysis system）分析 GH 基因部分序列 SNP 与鸡冠性状的关联性。【结果】 有 13 个 SNP 与 冠 高 性 状 指 标 显 著 关 联（P < 0.05）, 即 C1272225T、G1272611A、C1271211T、C1270902T、A1270769G、G1270640C、T1270578C、G1270503C、T1270451C、C1270032T,其中 A1270769G 与 7 个周龄冠高指标均显著关联;G1272611A 与 5 个周龄冠高指标显著关联;有 10 个 SNP 与冠长性状显著关联（P < 0.05）,即 C1272225T、G1272611A、C1271211T、C1270902T、A1270769G、G1270640C、T1270578C、G1270503C、T1270451C、C1270032T,其中 C1271211T 与 6 个周龄冠长指标显著关联,G1272611A 与 5 个周龄冠长指标显著关联。G1272611A 位点与 5 个连续周龄冠长或冠高性状指标均显著关联,该位点在该群体中对应 GG 和 GA 2 种基因型,GG 基因型个体的 5 个连续周龄冠高或冠长均显著高于 GA 基因型个体。【结论】G1272611A 位点可作为宁都黄鸡冠高和冠长性状选育重要候选分子标记。     

不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点筛选及其生物信息学分析

[目的]揭示刺豚鼠信号蛋白基因(ASIP)SNP位点突变与不同鸡种羽色差异形成机制的关联性,筛选出与鸡种羽色相关的辅助育种分子标记.[方法]参考NCBI已公布的红色原鸡ASIP基因序列(登录号NC_006107.5),运用Primer Premier 5.0设计特异性引物,以罗曼蛋鸡、泰和乌骨鸡、兴义矮脚鸡白羽系、赤水乌骨鸡、贵州黄鸡和瑶山鸡为研究对象,通过DNA混合池及PCR直接测序法筛选不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点;估算各SNP位点等位基因频率后,使用RNAfold、NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,探究不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点突变对基因mRNA二级结构、ASIP蛋白翻译后修饰位点及其二、三级结构的影响.[结果]从6个鸡种ASIP基因中检测到7个SNPs位点,分别为Exon-2-G17C、Exon-2-T168C、Exon-2-C3032T、Exon-2-T3203G、Exon-2-G3287A、Exon-2-G3313T和Exon-2-C3350T.其中,Exon-2-T3203G只出现在罗曼蛋鸡上,Exon-2-G3287A只出现在瑶山鸡上.Exon-2-T168C只出现在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系且位于编码区,该位点突变导致编码氨基酸改变[苏氨酸(Thr)→甲硫氨酸(Met)],且能导致ASIP基因mRNA二级结构改变,最小自由能增加,稳定性降低.Exon-2-T168C位点突变还导致ASIP蛋白激酶磷酸化位点数量和位置发生改变,但糖基化位点未发生改变;Exon-2-T168C位点突变后ASIP蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角和延伸链的占比增加,而无规则卷曲占比降低,且蛋白三级结构预测结果与二级结构预测结果一致.[结论]在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系ASIP基因上检测到Exon-2-T168C位点,且该位点突变能引起ASIP基因mRNA二级结构、蛋白激酶磷酸化位点数量和位置及ASIP蛋白二、三级结构均发生改变,但并不是影响贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系羽色差异的内在机制.     

大通牦牛TLR2基因SNP位点筛选及生物信息学分析

采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,对大通牦牛TLR2基因CDS区的SNP位点进行筛选,估算各SNP位点等位基因频率,并通过生物信息学软件预测突变对TLR2 mRNA和蛋白质结构的影响。结果表明,大通牦牛TLR2基因CDS区存在2个SNP位点,分别为G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A,其中G⁶⁷⁷A为错义突变,导致半胱氨酸(Cys)转变为酪氨酸(Tyr)。生物信息学分析结果表明,G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A位点均降低了mRNA二级结构的稳定性,且蛋白二、三级结构组成也发生了改变。     

zyxin基因SNP(exon 1)与京海黄鸡生长和屠体性状的相关性

以京海黄鸡为试验材料,采用PCR-SSCP技术检测斑联蛋白基因(zyxin)8个外显子SNP(单核苷酸多态性),探讨zyxin基因的多态性与鸡生长和屠体性状之间的关系。结果发现zyxin基因外显子1有1个SNP突变位点,表现为3种基因型,分别用AA、AB和BB表示。统计分析结果表明:BB型的公鸡腹部脂肪重、屠宰率显著高于AA型与AB型(P<0.05),AA型与AB型差异不显著。AB型的母鸡心重、胸肌率、腿肌率显著高于AA、BB型,而半净膛率、全净膛率低于AA、BB型。公鸡、母鸡的生长和屠体性状在不同基因型间比较,除了半净膛率以外,其余各指标均存在显著或极显著差异。以上研究结果表明,zyxin基因可能是影响京海黄鸡部分内脏组织、器官和屠宰率等相关指标的基因。     

云南4个地方鸡种PRL外显子5基因多态性研究

[目的]研究云南4个地方鸡种PRL外显子5基因的多态性。[方法]对云南地方鸡种剥隘小种鸡（BA）、大围山微型鸡（DW）、武定鸡（WD）、盐津乌骨鸡（YJ）4个鸡种P地基因第5外显子PCR-SSCP进行检测分析,并采用Progene,Editplus等软件进行数据分析。[结果]PcR-SSCP检测分析发现,PRL外显子5有4个SNP位点,均有多种基因型。在PRL-exon5681、742和816bp处呈现基因多态性,剥隘小种鸡、武定鸡、盐津乌骨鸡有AA、BB和AB3种基因型,大围山微型鸡有AA和AB2种基因型。PRLR-exon5950bp处有1个SNP,4种鸡均有AA、BB和AB3种基因型。[结论]A基因可能是影响繁殖性状的优势基因。     

文昌鸡MHC B-G基因第2外显子序列多态性分析

根据GeneBank上红色原鸡的MHC B-G序列设计特异性引物,利用PCR-SSCP和测序方法对文昌鸡18只个体的MHC B-G基因第2外显子序列332 bp区域进行序列多态性分析.通过PCR-SSCP分型得到16种基因型;测序检测到21个变异位点,其中20个位点导致16个氨基酸位点发生变异.结果表明:所有序列均未发生长度变化;文昌鸡群体内MHC B-G的多态性较丰富,主要体现在氨基酸多态性上,与其抗原多样性有密切关系.     

藏鸡和隐性白羽鸡GH基因的SNP检测及其与生长性状间的关联分析

 利用改良等位基因特异性PCR（Modified Allele Specific PCR, M-ASP）结合PCR-RFLP以及直接测序方法对藏鸡和隐性白羽鸡生长激素（Growth Hormone, GH）基因内含子4 （Intron4）的一个位点进行了SNP检测，并进行了该基因与藏鸡生长性状的关联分析。检测结果显示，GH基因Intron4的这个位点同时具有M-ASP和SacI-RFLP多态。测序结果表明，该位点发生了C→G的碱基突变，产生了CC、CG和GG三种基因型。两个等位基因和三种基因型在两鸡种中的分布基本一致。其中，基因型CC和等位基因C的频率最高。χ2检验结果表明，基因型频率或者等位基因频率在两鸡种之间没有显著差异（P＞0.05），而分别在两鸡种内部却存在显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）差异。方差分析结果表明，基因型与藏鸡的2周龄体重等12个生长性状有显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）关联；基因型CC与藏鸡的7周龄体重存在显著关联（P＜0.05）。这暗示了GH基因是影响藏鸡生长的主效基因或者它与主效基因相关，而该位点的碱基突变可以作为筛选藏鸡高的7周龄体重的分子标记。     

巢湖鸭Ghrelin基因外显子3的单核苷酸多态性及其对屠体性状的影响

[目的]检测巢湖鸭Ghrelin基因外显子3的单核苷酸多态性（SNPs）,并分析其与巢湖鸭屠体性状的关系。[方法]以巢湖鸭为试验群体,采用PCR-SSCP和DNA测序的方法检测鸭生长素（Ghrelin）基因外显子的3SNPs,并将所发现的SNPs与胴体重、半净膛重和全净膛重等屠体性状进行相关性分析。[结果]巢湖鸭外显子3第54bp处发生G→A的沉默突变,检测到AA、BB和AB3种基因型,该突变位点对巢湖鸭胴体重影响极显著（P〈0.01）,对半净膛重和全净膛重有显著影响（P〈0.05）,BB基因型在胴体重、半净膛重和全净膛重上显著高于AA型和AB型（P〈0.05）。[结论]Ghrelin基因多态性与巢湖鸭的部分屠体性状存在显著相关性,对B等位基因进行选择将有利于提高巢湖鸭的屠体指标。     

青藏高原海东鸡CAPN3基因第1外显子多态性研究

[目的]对青藏高原海东鸡CAPN3基因第1外显子的多态性进行研究。[方法]采用PCR-SSCP技术检测海东鸡CAPN3基因第1外显子的多态性。[结果]海东鸡CAPN3基因第1外显子存在c.223GA的错义突变,对应2种等位基因G和A,等位基因G为优势等位基因;该群体CAPN3基因检测区域0.25PIC≤0.5为中度多态,且偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P0.01)。[结论]该研究为海东鸡功能基因的分子遗传研究提供了基础资料。     

淮南麻黄鸡CRBP2基因第3外显子PCR-SSCP多态性及其与蛋品质的相关分析

利用PCR-SSCP和DNA测序技术对淮南麻黄鸡CRBP2基因第3外显子的多态性进行了检测,并分析其与蛋品质的相关性。结果表明:在淮南麻黄鸡样本群中CRBP2基因第3外显子存在C/T的突变位点,共检测到3种基因型(CC、CT和TT),C和T等位基因的频率分别为0.45和0.55,多态信息含量和杂合度分别为0.37和0.47,表明该位点处于中度多态。χ2适合性检验表明淮南麻黄鸡样本群在该位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P0.01)。淮南麻黄鸡CRBP2基因第3外显子各基因型间开产日龄、蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋黄色泽和蛋黄比率差异不显著(P0.05),CC基因型的开产蛋重和30周龄蛋重分别比TT基因型高1.66%和2.60%(P0.05),TT基因型的哈氏单位显著高于CC和CT基因型(P0.05)。     

FSHR基因第10外显子SNP的筛选及其与兔体质量性状的关联性分析

【目的】近年来,研究发现FSHR基因在非性腺组织中也有表达,能够介导FSH信号参与调控机体内多项生理活动。FSH-FSHR信号与脂肪沉积、体质量存在一定关联,但有关FSHR基因与兔体质量性状的关联还未见报道。【方法】本研究以天府黑兔为研究对象,采用PCR产物直接测序的方法对其FSHR基因第10外显子进行SNP筛选,并将基因型与兔各日龄体质量做关联性分析。【结果】测序结果经比对,在兔FSHR基因第10外显子发现突变g.163537 G>A和g.163619 A>G。其中g.163537 G>A为同义突变,处于低度多态(PIC<0.25),群体处于Hardy-Weinberg平衡;g.163619 A>G为错义突变,编码氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸,同样处于低度多态(PIC<0.25),群体处于Hardy-Weinberg平衡。对单位点基因型间体质量差异进行分析发现,g.163537 G>A位点对兔体质量影响不显著,但GG基因型个体的49、56及70日龄体质量高于GA和AA基因型个体,表明GG基因型增重速度较快;g.163619 A>G的AA基...     

藏猪肌肉生长抑制素基因外显子1的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了藏猪肌肉生长抑制素(MSTN)基因的单核苷酸多态性.根据GeneBank上猪MSTN基因全序列设计的两对引物,扩增了MSTN基因完整的外显子1,经SSCP分析,只有P1扩增产物存在多态性,表现为3种基因型(AA、AC和CC),A和C两种等位基因的频率分别为46.88%和53.12%.测序分析发现,CC型与AA型相比在MSTN基因编码区的第71bp处有一个A→C的单碱基突变,该突变导致编码的第24位氨基酸由天冬酰胺改变为苏氨酸.