利用CRISPR/Cas9技术构建gdf11基因敲除小鼠及其表型鉴定

为了探讨敲除生长分化因子11(gdf11)基因对小鼠生长性状的影响，本试验根据gdf11基因序列设计向导RNA(sgRNA)并利用规律成蔟的短间隔回文重复序列和CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas9)基因编辑系统对该基因进行敲除，利用显微注射的方法获得gdf11敲除型F0代小鼠，通过聚合酶链式反应(PCR)和测序鉴定子代小鼠基因型。繁育后观察F1代小鼠形态，并采用骨架染色方法观察不同基因型小鼠的性状。结果显示，成功构建了gdf11基因敲除小鼠，并且通过繁育得到了野生型(gdf11^+/+)、杂合型(gdf11^+/-)和纯合型(gdf11^-/-)3种基因型的小鼠；形态观察发现，与野生型小鼠相比，纯合型小鼠在围产期死亡且尾巴是截断的，骨架染色显示，野生型小鼠有13个胸椎和6个腰椎，纯合型小鼠有18个胸椎和9个腰椎。结果表明，敲除gdf11基因可能会影响小鼠胚胎和中轴骨发育从而改变小鼠的生长性状。     

脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠发生非酒精性脂肪肝

为了探讨脂肪组织特异性Sirt6基因敲除对小鼠肝脏的影响,利用CrE-LoxP系统获得脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠的基础上,通过组织病理学检查,Sirt6基因敲除小鼠和野生型小鼠的肝脏组织形态,进而提取两种基因型小鼠的肝脏组织RNA,通过实时定量PCR分析肝脏中参与脂肪生成的关键基因以及炎症标记物的表达水平。结果显示,成功获得脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠,组织病理学检查表明,无论是正常饮食还是高脂饮食,Sirt6基因敲除后小鼠均会发生脂肪肝并伴有炎症反应;此外,实时定量PCR的分析结果也显示,肝脏组织中参与脂肪生成的关键基因以及炎症标记物的表达均有明显升高。表明脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠发生非酒精性脂肪肝。     

DRD1基因敲除小鼠繁殖模式分析及鉴定

为获得纯合多巴胺D1受体(DRD1)基因敲除小鼠,试验引进敲除杂合子小鼠进行饲养繁殖,依据孟德尔遗传定律,子代应包含三种基因型(敲除纯合子、敲除杂合子及野生型)小鼠,需进行PCR鉴定。结果显示,DRD1基因敲除小鼠的饲养繁殖获得成功,目前已获得大量基因敲除纯合子小鼠。通过对DRD1基因敲除小鼠不同繁殖模式下小鼠的分娩数、总产仔数、平均每胎产仔数和成活数比较,发现杂合子的繁育能力最强,纯合子之间进行交配繁育能力最低。试验表明,正确的饲养繁殖以及可靠的鉴定方法可得到DRD1基因敲除鼠,且DRD1敲除杂合子小鼠较敲除纯合子小鼠繁育能力强,提示DRD1基因可能影响动物繁育能力,研究结果为动物繁育研究提供参考思路。     

使用TALENs技术构建丁酰胆碱酯酶敲除小鼠模型研究

为了使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术构建丁酰胆碱酯酶(BChE)敲除小鼠模型,试验设计多对TALENs组合,合成相应的载体,并通过3T3细胞系对这些载体的活性进行检测,选择出活性最高的组合进行体外转录获得TALENs mRNA,并注射入小鼠受精卵中,对子代小鼠进行基因测序并筛选,最终获得BChE基因敲除小鼠。结果表明:针对4个基因位点设计并构建了30对TALENs组合,选择最优3L3-3R1组合进行体外转录并注射入小鼠受精卵,获得4只携带突变的F0代嵌合体小鼠;通过杂交及筛选,最终获得4只携带移码突变的F1代小鼠,可用于交配繁殖。说明通过TALENs技术可以稳定可靠地制备BChE基因敲除小鼠,并用于后续BChE功能的研究。     

ALK3基因敲除小鼠的繁育及基因鉴定

为了繁育和鉴定ALK3基因敲除小鼠,将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后提取每种基因型小鼠组织基因组DNA,用PCR法进行鉴定,将其雄性杂合子与雌性杂合子交配。结果表明：ALK3杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。说明正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得ALK3基因敲除纯合子小鼠的有效途径。     

四联重组痘苗病毒的构建及筛选

构建含黄热病毒E基因、汉坦病毒S基因、克里米亚-刚果出血热病毒M基因及炭疽杆菌POAX2基因的重组天坛株痘苗病毒。设计合成含外源筛选标记EGFP基因和4种拟插入外源基因的重组质粒,利用同源重组和荧光标记筛选技术并结合Cre/Loxp敲除系统,最终构建四联重组痘苗病毒。应用PCR对获得的重组痘苗病毒进行鉴定和遗传稳定性的检测,并在电子显微镜下观察其形态特征。构建含4种外源基因的重组痘苗病毒rVTT-C-4＋,该重组痘苗病毒在转录水平上具有良好的遗传稳定性,且于电镜下观察具备完整形态。成功构建四联重组天坛株痘苗病毒,为后续疫苗研究奠定了基础。     

肝特异性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的建立

试验旨在建立肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞系,为获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。通过PCR方法分别从血液和pcDNA3.1(+)载体上扩增肝脏特异性启动子α1-抗胰蛋白酶启动子(PhAAT)和BGHpolyA片段。通过双酶切(XhoⅠ、SalⅠ)从载体pGC-FRT2neo上获得FRT2neo交换盒,再利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,最后通过三重融合PCR方法和酶切方法将4个片段连接。利用真核表达载体pC1-neo构建出Cre表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo。Lipofectamine^TM2000介导转染猪成纤维细胞,通过G418筛选出阳性细胞系,最后通过PCR鉴定证明构建的Cre重组酶表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo成功整合到细胞的基因组中,获得了肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。     

奶山羊BLG基因敲除载体的构建

根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体为基础,将5′端和3′端同源臂片段先后连入其中,进行酶切、PCR鉴定。将构建好的基因敲除载体转化组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌BM25.8,验证Loxp位点的活性。结果表明,构建了奶山羊BLG基因第2外显子缺失的基因敲除载体pBLG2T,且pBLG2T载体中的正选neo基因可以被Cre重组酶去除。为获得BLG 1条等位基因缺失型细胞株以及培育高产优质奶山羊新品种奠定基础。     

缺失TA35R基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选

通过敲除痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain,VTT)复制非必需基因TA35R,结合双筛选标记及同源重组技术,构建TA35R基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TA35R-。人工合成含有TA35R重组臂、同向loxp序列、早晚期启动子PE/L、EGFP及酶切位点的穿梭质粒pTA35R-EGFP。pTA35R-EGFP和野生型VTT共转染BHK-21细胞,通过绿色荧光蚀斑筛选,构建缺失TA35R基因且含FGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R--EGFP+。采用Cre/Loxp系统敲除外源筛选标记EGFP,获得缺失TA35R基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R-,利用PCR方法和电子显微镜对其进行鉴定,通过MTT法检测细胞噬性以评价其减毒效果。结果表明,所构建的痘苗病毒弱毒株rVTT-TA35R-完全缺失了TA35R基因和外源筛选标记EGFP,且细胞毒性减弱。     

弓形虫MIC11基因敲除株的构建及鉴定

本试验利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫顶端复合体微线体蛋白11(MIC11)基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶药物筛选、绿色荧光蛋白(GFP)观察及PCR技术进行体外和小鼠体内MIC11基因鉴定,确定单克隆敲除株KO-MIC11。结果表明,经乙胺嘧啶药物筛选和GFP确认,KO-MIC11株可在Vero细胞和小鼠体内稳定增殖,经PCR鉴定Vero细胞和接种后小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑及生殖器官中均能扩增出KO-MIC11株B1基因和GFP基因片段,但扩增不出MIC11基因片段。说明本试验成功构建并筛选出MIC11基因敲除的单克隆虫株,为弓形虫MIC11基因敲除株的致病性研究奠定了基础。     

蛋白磷酸酶2A催化亚基α在小鼠胚胎成纤维细胞迁移中的作用研究

利用体外基因敲除技术检测小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)周期和迁移能力的变化,探究蛋白磷酸酶2A的Cα亚基在MEFs细胞迁移过程中的作用。用Cαfl/fl的纯合子雄鼠与雌鼠1∶2配对,取E12.5d的胚胎制作小鼠胚胎成纤维细胞。利用表达Cre重组酶(Ad-Cre-EGFP)以及GFP荧光蛋白(Ad-EGFP)的腺病毒载体,对P3代MEFs进行感染,分别用PCR,RT-PCR和Western blot方法进行基因型鉴定。同时利用流式分选技术检测感染后MEFs的细胞周期的变化,利用细胞划痕试验检测了其细胞迁移能力的变化。结果显示,胰酶消化的方法成功获得了小鼠胚胎成纤维细胞,DNA,RNA和蛋白水平的鉴定获得了3对3的野生型和基因敲除MEFs。流式分选发现Ad-Cre处理的MEFs与Ad-EGFP处理的MEFs相比,处于G2期的细胞比例为30.8%±2.57%,高于Ad-EGFP MEFs的23.9%±2.46%,并且细胞碎片的比例也远高于后者。划痕试验表明,Cα亚基缺失后细胞迁移能力下降,12h就显著低于对照组。结果表明,腺病毒携带的Cre重组酶能够在体外有效地敲除掉MEFs中的蛋白磷酸酶2A的Cα亚基,PP2ACα亚基的缺失会导致MEFs细胞周期倾向于阻滞在G2期,并会降低细胞迁移的能力。     

天坛株痘苗病毒基因缺失弱毒株的构建及鉴定

本研究旨在通过敲除部分与天坛株痘苗病毒(vaccinia virus Tiantan strain,VTT)毒力和宿主范围等相关的复制非必需基因,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术,构建多基因缺失VTT弱毒株。人工合成7对重组臂,结合痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein,EGFP),构建穿梭载体质粒pTC-EGFP、pTA35-EGFP、pTA66-EGFP、pTE-EGFP、pTB-EGFP、pTI-EGFP和pTJ-EGFP。将上述质粒依次与VTT或基因缺失VTT共转/感染BHK细胞,并通过同源重组和荧光蚀斑筛选方法,逐一敲除拟缺失基因片段(TC:TC7L^TK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13RTK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13R^TB14R;TI:TI4L;TJ:TJ2R)。利用Cre/Loxp系统实现对外源筛选标记的敲除,最终获得天坛株痘苗病毒基因缺失弱毒株TTVAC7,并运用PCR方法对TTVAC7进行鉴定和遗传稳定性检测。结果表明,本研究成功构建了缺失7个目的片段的天坛株痘苗病毒弱毒株TTVAC7,且该弱毒株具有良好的遗传稳定性。     

弓形虫MIC10基因敲除株的构建及鉴定

为了解弓形虫MIC10基因特性,利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫MIC10基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶药物筛选、GFP绿色荧光观察及96孔板筛选阳性敲除虫株,并进行体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因进一步确定单克隆敲除虫株。结果表明,加入乙胺嘧啶后MIC10基因敲除株能够正常生长,在荧光显微镜下观察敲除株呈现绿色荧光,在96孔板的单孔中筛选出唯一绿色荧光虫体;经体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因,敲除虫株扩增出1 000 bp的外源片段,未扩增出MIC10基因片段,而在对照组RH虫株扩增出263 bp MIC10基因片段,未扩增出1 000 bp外源片段;说明本试验成功构建并筛选出MIC10基因敲除的单克隆虫株,暂命名为弓形虫KO-MIC10-RH。本试验为弓形虫MIC10基因敲除株的致病性研究奠定基础。     

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID_(50)测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。     

小鼠Wip1基因的表达及其对受精能力的影响

本研究旨在探讨Wip1基因的表达及其对精子受精能力的影响,为阐明Wip1基因对雄性繁殖的影响提供新的着眼点。选取相同饲养环境、同一遗传背景的8周龄左右的野生型雄鼠,利用实时荧光定量PCR技术检测Wip1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织及雄性生殖器官中的表达情况,利用免疫荧光技术检测Wip1蛋白在睾丸组织及精子细胞中的分布情况。以Wip1敲除型雄鼠为试验组,野生型雄鼠为对照组,利用ELISA试剂盒检测两组小鼠血清中睾酮水平;通过体外受精试验比较两组的2-细胞率及囊胚率。结果显示,Wip1基因mRNA在野生型雄鼠各组织中广泛表达,且在雄性生殖器官中表达量较高,其中睾丸中表达量最高,附睾体、附睾头、附睾尾次之;Wip1蛋白主要定位于睾丸组织中的长形精子细胞及附睾成熟精子细胞的头部。ELISA检测结果发现,与野生型雄鼠相比,Wip1敲除型雄鼠血清内睾酮含量极显著下降（P<0.01）。体外受精结果表明,Wip1敲除后2-细胞率及囊胚率均极显著下降（P<0.01）。结果表明,Wip1基因敲除能够引起雄性小鼠受精能力降低,这可能与Wip1基因在精子发生过程中发挥作用相关。     

鸡促卵泡素及其受体基因在多个非繁殖组织中的表达研究

本研究利用PCR和免疫组化等方法,对FSHR和FSH基因在鸡多个非繁殖系统的组织器官中的mRNA和蛋白水平的表达以及相关性进行了分析.结果显示:在心脏、肝脏、肾脏、肺和十二指肠中FSHR mRNA和蛋白以及FSH蛋白水平具有相同的表达趋势,表达丰度从大到小依次为肝脏、心脏、肾脏、肺和十二指肠.而在脾脏、胃、腿肌和胸肌中未检测到FSHR mRNA和蛋白以及FSH蛋白水平的表达;在检测的9个组织中,均无FSHmRNA的表达.相关性分析结果表明,在肝脏、心脏、肾脏、肺和十二指肠中各组织器官质量与组织中的FSH蛋白水平具有显著或极显著的正相关(P＜0.05或P＜0.01);各组织中的FSHR mRNA和蛋白水平均与FSH蛋白水平存在显著或极显著正相关(P＜0.05或P＜0.01).本研究初步证明,机体其他部位表达分泌的促卵泡素,在多个非繁殖组织器官(肝脏、心脏、肾脏、肺和十二指肠)中通过调控促卵泡素受体基因的表达来影响北京油鸡不同组织的发育.     

敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID_(50)。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I~(-/-)),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I~(-/-)的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID_(50)测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。     

马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒(MDV)感染性克隆基因组中细菌人工染色体(BAC)序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒。将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1~10代不同代次SC9-1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示,1~5代病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列。6~10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7%以上。结果表明,利用cre/loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDV meq基因缺失株SC9-1的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。     

CRISPR/Cas9介导RB1基因敲除及其在鸡前脂肪细胞分化、增殖中的功能研究

旨在研究RB1基因在鸡前脂肪细胞分化和增殖过程中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统在鸡前脂肪细胞中敲除RB1基因,检测鸡前脂肪细胞的分化和增殖能力及相关标志基因的表达水平。结果表明,CRISPR/Cas9系统能够有效介导RB1基因的敲除并引起RB1基因翻译的提前终止,敲除效率可以达到10%。油红O提取比色和CCK-8的结果显示,敲除RB1基因后,鸡前脂肪细胞的分化能力减弱、增殖能力增强;qRT-PCR结果显示,RB1基因敲除之后脂肪细胞分化标志基因G0S2、FAS、A-FABP的mRNA表达水平下降,尤其是G0S2基因的表达水平在前脂肪细胞分化的各个阶段都表现为显著的下降。同时RB1基因敲除还引起细胞周期相关基因CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA的mRNA表达水平升高。初步推断,RB1基因可能是调控鸡前脂肪细胞分化和增殖的关键调节因子。     

牛FABP3转基因小鼠的遗传及表达特性研究

旨在研究和分析牛FABP3基因在小鼠体内遗传和表达特性,对培育优质高产转基因肉牛新品种具有重要意义。本研究利用前期获得的4只FABP3转基因小鼠,通过制定的4组交配方案获得子代小鼠,并利用PCR、实时荧光定量PCR和组织原位表达技术对转基因牛FABP3基因小鼠的子代遗传特征,以及FABP3基因在G0代和G1代小鼠心、肝、肾、骨骼肌组织的表达情况进行了检测。RT-PCR检测结果表明,在G0代转基因小鼠中,牛FABP3基因能够表达;牛FABP3基因在转基因小鼠中可以遗传,G1代转基因小鼠平均阳性率达68.4%;相对定量PCR结果表明,转基因小鼠总FABP3基因在G1代小鼠心肌和骨骼肌中表达量相对于阴性个体有不同程度的增加;组织原位检测表明,在G0代个体中表达量较高,G1代个体中虽能看到绿色荧光,但略有降低。本研究表明,牛FABP3基因存在于小鼠基因组中,并能够被表达,且可以遗传给后代,这为后期进一步研究牛FABP3基因对小鼠骨骼肌脂肪含量的影响奠定坚实基础。