CRISPR/Cas9系统在园林植物中的研究展望

CRISPR/Cas9系统是近年来迅速发展起来的一种新型基因编辑技术,作为一种高效的育种研究技术已在多种植物中实现了定点突变,具有广阔的应用前景。园林植物观赏性状的改良对丰富园林景观具有重要的作用,但是园林植物的遗传背景复杂,严重制约了基因编辑技术的应用。该文介绍了CRISPR/Cas9系统的基本原理及在植物中的研究进展,总结了CRISPR/Cas9系统针对不同类型植物适合的筛选方法及目前存在的问题,并展望了该技术在园林植物育种中的发展前景,以期能够高效利用CRISPR/Cas9系统改良无基因组参考的植物,快速获得观赏价值高的新品种。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在果树作物中的应用研究进展北大核心CSCD

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已成为一种有价值的基因组编辑工具,能够在特定选择的位点改变DNA序列,可以在作物基因组的靶点位置精确地实现删除、替换或插入特定序列,引入理想的目标性状。该工具具有简单、高效、成本低以及功能强大等特性,在柑橘、葡萄、香蕉和草莓等果树中已实现多种类型的应用,包含产生白化表型、调控童期和花期、调控果实品质以及创造矮化和抗病虫害品种等。综述了CRISPR/Cas9系统及其作用过程,介绍了新开发的精准编辑技术,包括单碱基编辑器、引导编辑及CRISPR/Cpf1多基因编辑系统,并详细阐述了CRISPR/Cas9系统在果树基因组编辑中的应用进展,包括果树种类、目标基因及目标性状等,归纳了CRISPR/Cas9系统实现高效编辑所遇到的遗传转化和再生体系、脱靶效应和启动子选择问题,最后提出了不断优化遗传转化和再生体系、合理选择靶位点和设计sgRNA、植物内源启动子及新编辑技术的解决策略。     

CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。     

利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点

西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。     

利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3∶GUS转入'茄梨'愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proDAM3∶GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型.结果 表明,共有4个转基因株系在靶...     

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。     

利用西瓜愈伤组织快速检测CRISPR/Cas9基因编辑效率

西瓜作为重要的园艺经济作物,其CRISPR/Cas9基因编辑效率的快速检测方法仍十分匮乏。以愈伤组织再生能力强的野生西瓜种质ZTC为试验材料,针对西瓜ClPDS基因构建CRISPR/Cas9双靶点敲除载体,利用农杆菌侵染西瓜幼嫩子叶,在含1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸生长素的MS培养基中诱导愈伤组织形成,通过绿色荧光蛋白标记筛选阳性愈伤组织,检测其编辑效率。结果表明,2个靶点均发生基因编辑,靶点1处的编辑效率为42.95%,靶点2处的编辑效率为29.92%。在愈伤组织中建立了西瓜生长发育早期有效基因编辑效率检测体系,为后续编辑株系的确定节约了大量时间,为基因编辑技术应用于西瓜重要农艺性状改良及优异种质创制提供了技术支撑。     

研究人员将用基因编辑技术唤醒番茄的辣味基因

来自巴西和爱尔兰的研究人员称,他们正在使用CRISPR/Cas9基因编辑技术制造辣味番茄,这些番茄可以用来制作辣椒喷雾、麻醉剂和减肥药等。巴西维索萨联邦大学的阿古斯丁·泽斯哥恩和他的团队在近期出版的《植物科学趋势》中表示,像CRISPR/Cas9这样的基因编辑技术可以“唤醒”番茄中休眠的辣味基因。他们在努力进行制造辣味番茄的工作,希望在2019年年底之前有一些好消息。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2）,在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1,构建CRISPR/Cas9敲除载体,通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序,结果表明,共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变,编辑效率为32%;突变体植株生长势较弱,叶片较小,茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测,结果表明,接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后,突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝,表皮细胞产生大量明显的H2O2,而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器,无明显H2O2产生。这些结果表明,可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2,提高葡萄白粉菌抗性。     

农杆菌介导的Cas9基因转化金针菇的研究

将酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9序列(SpCas9序列,Addgene#43802)根据金针菇(Flammulina velutipes)的密码子偏好性进行优化,并构建FvCas9双元表达载体,利用农杆菌介导法转化金针菇单核体Dan3,经抗性培养基筛选以及潮霉素和Cas9基因PCR扩增验证,结果显示Cas9基因已经成功转入金针菇菌丝体中,转化率为6.84%。     

二倍体马铃薯StBRC1a功能缺失突变体的获得及其功能分析

为研究二倍体马铃薯TCP转录因子基因StBRC1a的功能，在二倍体马铃薯Solanum tuberosum group phureja S15-65中对StBRC1a进行了克隆，发现StBRC1a有两个不同长度的转录本，分别命名为StBRC1aL与StBRC1aS。序列分析后发现，二者均具有TCP转录因子家族特有的由59个氨基酸组成的非典型碱性—螺旋—环—螺旋（bHLH）结构域及1个R结构域。通过构建系统演化树发现，StBRC1aL和StBRC1aS与番茄的SlBRC1a具有最近的亲缘关系，同属于CYC/TB1类TCP转录因子。组织特异性表达分析的结果表明StBRC1aL与StBRC1aS在腋芽中特异性的高表达。通过CRISPR/Cas9系统构建StBRC1a功能缺失的纯合突变体后发现，与野生型相比突变体植株表现为分枝显著增多的表型，说明StBRC1a对于二倍体马铃薯的分枝具有抑制作用。     

CRISPR/Cas9介导柑橘CsLOB1基因启动子的多位点编辑

为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别对CsLOB1启动子同时进行2个位点和3个位点的编辑。测序结果表明pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites的基因编辑效率分别为64.7%和80.0%,突变体植株在2个sgRNA之间发生了DNA片段的删除。进一步的分析发现,不同的sgRNA具有不同的突变效率,其差异是由于不同的sgRNA对CsLOB1-识别和结合能力的差异造成的。本结果表明对CsLOB1启动子进行多位点编辑可以获得删除较大DNA片段的突变体。     

Construction of SETD2 gene knockout nasopharyngeal carcinoma cell strains using CRISPR/Cas9 technique and analysis of their proliferation property

AIM:To establish SETD2 gene knockout nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell strains based on CRIPSR/Cas9 technique and to analyze their proliferation characteristics. METHODS:Sub-quantitative RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of SETD2 in immortalized nasopharyngeal epithelial cell line NP-69, well differentiated NPC cell line CNE1, poorly-differentiated NPC cell line CNE2Z and undifferentiated NPC cell line C666-1, and the SETD2 high expression cell line CNE1 was screened. The proliferation ability of CNE1 cells before and after the SETD2 gene knockout was analyzed by CCK-8 and colony formation assay. The cell cycle distribution was detected by flow cytometry, and the expression of cell cycle-related proteins was detected by Western blot. RESULTS:Compared with NP-69 cells, the expression of SETD2 was decreased gradually in CNE1, CNE2Z and C666-1 cells (P<0.01). Based on the CRISPR/Cas9 technique, 2 monoclonal cell strains with SETD2 gene stable knockout, named CNE1-SETD2-KO-#5 and #9, were successfully screened from total 15 monoclones. The results of CCK-8 and plate colony formation assay confirmed that the proliferation ability of CNE1-SETD2-KO-#5 and #9 cells was significantly enhanced compared with CNE1-WT cells (P<0.05). The results of flow cytometry analysis showed that the G₁ phase of CNE1-SETD2-KO-#5 and #9 cells was decreased, while the G₂/M and S phases were increased significantly (P<0.05). The results of Western blot confirmed the increases in the protein levels of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cyclin D1, cyclin B1, cyclin A2, cyclin E1, cyclin-dependent kinases 2 (CDK2) and CDK4, and the decrease in the protein level of p21 after SETD2 gene knockout (P<0.05). CONCLUSION:The NPC cell strains with SETD2 gene knockout were successfully constructed based on CRISPR/Cas9 technique. SETD2 expression correlates with cell differentiation status in the NPC cells. SETD2 gene knockout promotes NPC cell proliferation by up-regulating cyclin D1, cyclin B1, cyclin A2, cyclin E1, CDK2 and CDK4, and down-regulating p21 expression.     

FERMT2 expression in hepatocellular carcinoma and its effect on cell growth

AIM: To identify the expression of fermitin family homolog 2 (FERMT2) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and the effect of FERMT2 on the cell growth and related protein expression. METHODS: Real-time PCR and immunohistochemistry were used to detect FERMT2 expression in the HCC tissues. The technique of CRISPR/Cas9 was applied to construct stable FERMT2 knockout MHCC97H cell line. WST-1 assay and flow cytometry were used to measure the cell viability, cell-cycle distribution and cell apoptosis. Western blot was used to determine the expression of related proteins in the MHCC97H cells. RESULTS: In HCC tissues, the expression level of FERMT2 was higher than that in adjacent liver tissues (P<0.05). High expression of FERMT2 was significantly correlated with postoperative recurrence of tumor. Knockout of FERMT2 gene evidently inhibited MHCC97H cell viability and accelerated cell apoptosis. Meanwhile, the expression levels of proliferating cell nuclear antigen, cyclins, cyclin-dependent kinases 2 and anti-apoptotic factors were significantly downregulated in MHCC97H cells with FERMT2 knockout (P<0.05). CONCLUSION: FERMT2 may function as a promoter of hepatocarcinogenesis and progression via regulating the cell viability, cell-cycle distribution and cell apoptosis, which is related with the expression of cell cycle regulators and anti-apoptotic factors.