牛卵母细胞对成纤维细胞重编程作用

转录因子nanog和oct-4是细胞具有多潜能性的关键调控因子,一般认为它们的表达是细胞具有多潜能性和自我更新能力的标志.本研究将牛成纤维细胞(BEF422)分别移入GV期和MⅡ期卵母细胞,体外培养24 h后,RT-PCR检测其nanog和oct-4基因的表达情况,并用免疫荧光染色法对这两个基因在移植卵中的分布进行定位.结果表明,牛成纤维细胞移植入GV期和MⅡ期卵母细胞培养后,nanog和oct-4基因均被诱导表达,并且明显定位于移植细胞的细胞核上,而成纤维细胞组和未注射成纤维细胞的空白卵母细胞组中均未检测到nanog和oct-4的表达.说明GV期和MⅡ期卵母细胞均能激活成纤维细胞中转录因子nanog和oct-4的表达,使其发生重编程.本研究选取GV期和MⅡ期这两个关键时期的卵母细胞为研究对象,为进一步解释卵母细胞中含有的与供体细胞重编程相关的物质及作用机理提供了一定的基础资料.     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

山羊-绵羊异质体细胞克隆胚中线粒体DNA的杂合性分析

摘要：线粒体是哺乳动物细胞中唯一存在有核外遗传物质的细胞器，其功能的正常表达需要核与线粒体的相互作用。线粒体 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)编码电子传递链所需酶中的一些多肽亚基及多种 tRNA 和 rRNA，其余的亚基由核基因编码。异种体细胞核移植可能导致重构胚中 mtDNA 的杂合现象。本实验采用 PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）的方法分析以山羊胎儿成纤维细胞为核供体，以去核的绵羊 MⅡ 期卵母细胞为核受体构建的异质克隆胚中线粒体的来源及组成比例。结果表明： 8-cell之前的异质克隆胚中供受体 mtDNA 的比例变化不大，1-cell、2-cell、4-cell、8-cel异质克隆胚中核供体细胞 mtDNA 占受体细胞 mtDNA 的比例分别为2.5±0.8 %；2.8±0.6 %；1.9±0.4 %；1.7±0.6 %， 彼此之间差异不显著（P>0.05）；然而，异质克隆囊胚中核供体细胞 mtDNA 的比例下降为0.3±0.1 %，与前四者相比差异显著（P<0.05）。     

SAHA对水牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育潜能的影响

卵母细胞体外成熟过程中组蛋白修饰发生了剧烈的变化,其表达模式的改变对卵母细胞的成熟乃至后续胚胎的发育有着至关重要的作用.去乙酰化酶抑制剂-伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)作为新型抗癌药物,是组蛋白去乙酰化酶的潜在抑制剂,在体内和体外抑制多种类型肿瘤细胞生长并促进其分化和凋亡.为探讨组蛋白去SAHA对水牛Bubalus bubalus)卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0,2,5,10,20和40 nmol/L)SAHA处理成熟期的水牛卵母细胞对其成熟率(第一极体排出率)、受精卵分裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的影响.结果表明,10 nmol/L SAHA处理组成熟率、卵裂率、囊胚率显著高于对照组((77.07±1.79)％和(62.3士2.08)％,(86.81±1.93)％和(74.86±2.07)％,(27.56±2.86)％和(24.23±1.74)％,P＜0.05).随着浓度增加,各处理组囊胚总细胞数有提高的趋势,但组间差异不显著(141±10,151±13,165±17,170±14,147±20,185士22,P＞0.0S).qRT-PCR检测结果显示,SAHA对水牛卵母细胞成熟过程的处理,均显著下调了cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein,CREB)结合蛋白基因CBP、组蛋白乙酰转移酶1基因(histone acetyltransferases 1,HAT1)、组蛋白去乙酰化酶1基因(histone deacetylase 1,HDAC1)在MⅡ期卵母细胞中的表达,P300则有所上调.实验结果表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理是一种能够提高水牛卵母细胞体外成熟效率促进胚胎发育的有效途径之一,该研究结果可为今后研究转基因克隆胚胎发育相关基因调控机理提供了理论基础.     

荧光染色及紫外照射(UV)对黄牛孤雌和克隆胚胎早期发育的影响

探讨荧光染色及紫外照射对牛孤雌和克隆胚胎体外发育的影响。结果发现，1／4倍UV照射20、30、40S的卵母细胞孤雌激活后囊胚发育率都极显著低于UV照射0S和10s组；以1、1／4、1／8、1／32倍的UV强度照射黄牛卵母细胞20S，其中1／4倍UV照射组的分裂率与1／8、1／32倍UV照射组无显著差异，但囊胚率间差异显著。以1倍UV强度照射组的分裂率与囊胚率均显著低于1／8、1／32倍UV强度照射组；观察培养24h后原核形成情况，发现1倍UV强度照射组原核形成也显著滞后于其它处理组；比较1、1／8倍UV强度照射引导去核胞质构建的重组胚体外早期发育情况，发现1倍UV强度照射引导去核胞质重组胚的卵裂率及囊胚率极显著低于1／8倍UV照射强度引导去核胞质组。以上结果表明：1／4倍UV强度照射黄牛卵母细胞时间大于20s，显著降低其孤雌激活后的卵裂和体外发育潜力；1、1／4倍UV照射强度可阻滞原核形成，降低UV照射强度可提高胚胎孤雌发育率；1／8倍UV照射强度可用于引导去核操作。     

供体细胞和曲古抑菌素(TSA)对奶牛克隆胚胎发育的影响

本研究探讨供核细胞处理策略(新鲜消化、-196℃冻存组(复苏后)和曲古抑菌素(TSA)处理组)和TSA-CR1aa胚胎培养液处理时间对克隆胚发育的影响。利用体细胞核移植技术生产奶牛克隆胚胎,将部分克隆胚移植给自然发情同步的受体,检验克隆胚的体内发育能力。结果显示:TSA处理体细胞组的克隆胚卵裂率和囊胚率与新鲜消化和-196℃冻存组相比差异显著(P<0.05);-196℃冻存组与新鲜消化组差异不显著;用TSA-CR1aa分别处理新鲜消化细胞构建的克隆胚0、24、48和60h,其中,60h处理组的囊胚率最高(36.11±1.78%)与其他组对比差异显著(P<0.05);用TSA-CR1aa分别处理TSA处理组构建的重构胚24、48和60h,结果发现,60hTSA-CR1aa处理组囊胚率(37.39±1.78%)最高,显著高于24h(25.48±1.34%)TSA-CR1aa处理组,且差异显著(P<0.05)。将所获得的克隆胚胎分别移植给40头自然发情的受体母牛,并观察移植25,45,65和90d后的返情情况,结果显示,各组受孕率无统计学差异,但经TSA处理细胞和胚胎组移植的受体中,获得一头存活的体细胞克隆奶牛。说...     

亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A对东北野猪核移植胚发育的影响

体细胞克隆的效率一直较低,这可能与成熟前卵母细胞的质量有关。猪卵母细胞主要来源于屠宰场的废弃卵巢,这暗示,卵母细胞可能处于发情周期的各个阶段。因此,体细胞核转移之前有必要筛选优质卵母细胞。本研究旨在探讨亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A(TSA)对东北野猪(Sus scrofa ussuricus)核移植胚发育的影响。卵丘卵母细胞复合体经亮甲酚蓝(BCB)染色后分三组:BCB+组(胞质着色,葡萄糖-6-磷酸脱氧酶(G6PDH)活性低)、BCB-组(胞质未着色,G6PDH活性高)和对照组(不使用亮甲酚蓝染色)。卵母细胞体外成熟培养后,对卵母细胞进行核移植操作,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚使用50nmol/LTSA处理,未使用TSA处理的来源于BCB+卵母细胞的核移植胚作为对照组。结果表明,BCB+卵母细胞的直径显著大于BCB-组(P<0.05)。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的初次卵裂时间要早于BCB-组及对照组。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的囊胚形成率显著高于BCB-组及对照组(P<0.05)。且50nmol/LTSA处理可将来源于BCB+卵母细胞的核移植囊胚率提高到(29.6±2.8)%(P<0.05)。总之,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚发育能力较强,且50nmol/L的TSA可促进重构胚的体外发育。对卵母细胞进行BCB染色筛选并使用50nmol/L的TSA处理重构胚,可提高东北野猪核移植重构胚的发育能力,为通过体细胞克隆法保护东北野猪资源创造条件。     

牦牛瘦素受体基因(LEPR)多态性分析

瘦素受体(LEPR)是瘦素(leptin)发挥作用的重要中介物.LEPR基因突变与人的肥胖,以及普通牛、猪等动物的脂肪沉积相关.本研究根据GenBank中普通牛(Bos tauras)LEPR基因序列设计3对引物,采用PCR-SSCP方法检测天祝白牦牛、甘南牦牛和青海牦牛(Bos grunniens)LEPR基因第4、5及8外显子及其相邻区域多态性.结果表明,牦牛LEPR基因第4外显子和第8外显子及其相邻区域分别存在多态性.对应普通牛LEPR基因序列,3类群牦牛该基因第4外显子及相邻区域检测到5处单碱基突变并形成2种等位基因A和B,第4外显子存在2处错义突变;该区域A为优势等位基因,PIC＜0.25为低度多态.3类群牦牛LEPR基因第8外显子及其相邻区域发现5处SNPs,其中第8外显子存在3处错义突变;等位基因在牦牛群体间分布不均衡,除天祝白牦牛发现6种等位基因A-F外,其余两类群牦牛仅发现3种等位基因A-C;3类群牦牛中A均为优势等位基因,该位点PIC>O.25,为中、高度多态且显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05).3类群牦牛LEPR基因第5外显子及相邻区域未发现多态性,但相对于普通牛该基因序列,在第4、5内含子区存在3处SNPs.LEPR基因第8外显子编码识别和结合相应配体的C2区,牦牛LEPR基因存在较丰富的多态性,可作为其调控性状的潜在分子标记位点.     

甘肃境内6个牦牛群体微卫星标记遗传多样性及遗传结构分析

为了研究甘肃境内牦牛(Bos grunniens)群体的遗传多样性和遗传结构,促进甘肃境内牦牛群体遗传资源的合理利用和保护,研究采用微卫星标记技术检测了甘肃境内6个牦牛群体(240头个体)15个微卫星座位的等位基因。结果共检测到了146个等位基因,其中在玛曲牦牛群体检测到的等位基因数最多(106个),天祝白牦牛群体最少(74个)。期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)的分析结果表明,6个牦牛群体中来自于合作市的3个牦牛群体的遗传多样性较丰富,而天祝白牦牛、肃南牦牛和天祝牦牛群体的遗传多样性相对较低。DA遗传距离和Nei氏标准遗传距离(DS)的分析结果以及DA和DS遗传距离构建的NJ系统树的分析结构均表明,玛曲牦牛、碌曲牦牛和夏河牦牛群体具有较近的亲缘关系,说明这3个群体可能具有相同的原始祖先。天祝白牦牛、肃南牦牛和天祝牦牛群体的遗传距离较近,另为一类,可能来源于相同的原始祖先。主成分分析和遗传结构推导分析的结果与系统树的分类结果一致,研究将甘肃境内的6个牦牛群体分为两个类群,分类结果与其地理分布具有一致性。     

促黄体生成素和17β-雌二醇对牦牛输卵管糖蛋白表达的影响

为研究相关激素是否通过体细胞参与哺乳动物胚胎发育的调控,本研究探讨了促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)和17ββ-雌二醇(17β-estradiol,E2)对牦牛(Bos grunniens)输卵管上皮细胞分泌输卵管糖蛋白(oviductin,Ovn)的影响.体外培养牦牛输卵管上皮细胞,分别添加0、10、25、50、100和200 ng/mLLH和E2,作用72h后,运用qRT-PCR和免疫荧光技术,从基因和蛋白水平检测Ovn表达.获得如下结果:(1)LH和E2可以提高牦牛输卵管上皮细胞的Ovn mRNA相对表达量;当LH浓度为10 ng/mL时,Ovn mRNA的相对表达量最高,显著高于LH浓度为25、50、100和200 ng/mL组(P＜0.05),对照组Ovn mRNA的表达量最低(P＜0.05);当E2浓度为25 ng/mL时,输卵管上皮细胞的Ovn mRNA相对表达量最高,显著高于E2浓度为10、50、100和200 ng/mL组(P＜0.05),对照组Ovn mRNA表达量最低(P＜0.05).(2)Ovn主要分布于核膜,细胞质也有表达;LH和E2可以提高输卵管上皮细胞的蛋白相对表达量,当LH浓度为10ng/mL时,Ovn的蛋白表达量达到最高,LH浓度达到25 ng/mL时,Ovn的蛋白表达量降低;当E2浓度为10～25 ng/mL时,Ovn的蛋白表达量随着E2浓度的上升不断增加,在25 ng/mL的E2作用后,Ovn的蛋白表达量达到最高,E2浓度达到50 ng/mL时,Ovn的蛋白表达量降低.上述结果表明,LH和E2对牦牛输卵管上皮细胞分泌Ovn具有明显的促进作用,LH的最佳作用浓度为10 ng/mL,E2的最佳作用浓度为25ng/mL.本研究为揭示LH和E2对输卵管上皮细胞分泌Ovn的作用机制提供了基础资料,为进一步研究相关激素对牦牛胚胎发育的调控提供了一定理论依据.