梅PmmiR319a与靶基因PmTCP2的验证与表达分析

为验证PmmiR319a与PmTCP2基因的靶标关系,并研究PmmiR319a在梅花芽发育过程中的作用,本研究以梅品种‘大嵌蒂’为试验材料,克隆梅PmmiR319a前体序列及其靶基因PmTCP2,采用5'RACE技术对两者之间的靶标关系进行验证,并进一步分析在花芽发育过程中的表达模式。结果表明,梅PmmiR319a前体序列含有茎环结构,通过序列比对和系统发育分析发现,不同物种的miR319a前体序列的茎环发卡结构和成熟体区域表现出较高的保守性。梅PmTCP2基因全长1 500 bp,编码499个氨基酸。荧光定量PCR分析结果表明,PmmiR319a在梅花发育的前期表达量高,而PmTCP2在梅花发育的中期和后期表达量较高,PmmiR319a与预测靶基因PmTCP2的表达模式呈负相关,表明二者存在负调控的关系,与预测的靶标关系一致。RLM-5'RACE技术验证结果表明,PmmiR319a对其靶基因PmTCP2的mRNA进行了切割,切割位点位于第10和第11个碱基之间。由此可知,PmmiR319a通过调控靶基因PmTCP2影响花的发育。本研究结果为阐明梅花中miR319a的功能提供了一定的理论依据。     

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系，采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点，构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列，构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA)，再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明，预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后，VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P < 0.05)，VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P ＞ 0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性，验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。     

藏绵羊毛囊组织中microRNA-31的表达量变化

microRNA是一种小分子非编码RNA,参与生物生命过程的多个环节,其对细胞增值,细胞分化,组织发育等都有重要的调控作用.为了研究microRNA-31在绵羊毛囊发育中的作用,本研究以藏绵羊(Ovis aries)毛囊组织为研究材料,利用荧光定量PCR(qPCR)方法检测了microRNA-31在毛囊3个不同发育时期中的表达变化情况,并对绵羊microRNA-31进行了基因组定位及前体预测,预测了2个可能的靶基因Keratin17 (KRT17)和distal-less homebox3(DLX3),并进行了qPCR验证.结果发现microRNA-31的表达量从毛囊的生长期到休止期呈下降趋势,其序列定位在绵羊2号染色体上.研究结果提示,microRNA-31在绵羊毛囊发育中可能发挥着重要作用,KRT17可能是受其调控靶基因之一.     

桑树中miR319的克隆及在雄花发育中表达分析

为探究miR319及靶基因在调控桑树雄花发育的分子机制,本研究通过石蜡切片技术判断桑树雄花芽发育时期及在线网站预测miR319的靶基因。结果表明,桑树雄花芽发育分为未分化期(A1)、分化初期(A2)、花序分化期(A3)和总苞形成期(A4)4个不同的阶段;桑树中miR319家族存在miR319a、miR319b和miR319c 3个成员,其中miR319b与miR319c位于同一条前体序列上,预测并获得了miR319 6个靶基因。运用5'-RACE技术验证了miR319a的4个靶基因,其切割位点主要集中在与miRNA互补位点的第10和第11位碱基之间。采用RT-qPCR技术检测miR319a及靶基因在雄花发育不同阶段的表达水平,发现miR319a在雄花发育A2-A3阶段表达水平迅速降低,靶基因Morus012208、Morus008229、Morus008100与Morus005893在此阶段表达水平迅速升高,茉莉酸(JA)含量也迅速升高。同时,JA合成关键基因PLDα1和LOX5在雄花发育A2-A3阶段表达上调,表明miR319通过调控靶基因影响JA合成来调控桑树花序分化。本研究为揭示桑树miR319在JA途径中调控花发育中的分子调控机制奠定了一定的理论基础。     

鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的表达谱分析

为研究microRNA(miRNA)在鸡胚早期性分化过程中的表达,探讨miRNA在性腺早期发育中的作用,本研究从前期以3.5～6.5 d的雌、雄鸡(Gallus gallus)胚胎性腺为材料的miRNA芯片表达谱中筛选出6个性别差异表达的miRNAs(其中miR-551b和miR-612为鸡新miRNAs),采用RNA加尾以及引物延伸的半定量RT-PCR方法研究这些差异表达miRNAs在3.5～6.5 d雌、雄鸡胚性腺中的表达,并验证其中新miRNAs的茎环前体结构.RNA folding软件折叠结果表明,预测的鸡miR-612和miR-551b均具有茎环状的前体结构.半定量结果表明,这6个miRNAs均存在不同程度的性别差异表达.除4.5 d外,gga-miR-612和gga-miR-1456在其它检测时期的表达为雌性高于雄性;在4.5～6.5 d鸡胚性腺中,gga-miR-551b在雄性中表达显著高于雌性(P<0.05);gga-miR-126在3.5和6.5 d雌性性腺中的表达低于雄性,而4.5和5.5 d则相反;gga-miR-1599在所检测时期中均为雄性中高表达且在4.5 d达极显著水平(P<0.01),gga-miR-10b的表达与之相反.根据表达谱结果推测gga-miR-551b以及gga-miR-1599可能涉及早期鸡胚性腺发育过程.     

MicroRNA(miR)-27b在山羊生长过程中的组织表达谱分析

本研究旨在分析microRNA(miR)-27b在安徽白山羊(Capra hircus)和波尔山羊生长发育过程中的表达变化,以了解其在山羊肌肉发育中的重要作用.选用安徽白山羊和波尔山羊不同发育时期(初生,6月龄和12月龄3个时期)背最长肌为材料,利用Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)方法检测miR-27b的表达变化.同时,分析了miR-27b在6月龄山羊各组织中(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腿肌和胸肌)的表达.并用MEGA3.1分析miR-27b在不同物种中的保守性.结果显示,miR-27b在安徽白山羊和波尔山羊骨骼肌发育过程中差异表达,呈现不同的表达模式.安徽白山羊12月龄背最长肌miR-27b表达最高,初生时最低.在山羊不同组织中,骨骼肌和心脏中miR-27b表达量较高,肝脏和肾脏中miR-27表达处于中度水平,而在另外4种组织中表达量较低.实验结果表明,miR-27b可能参与山羊肌细胞增殖和分化,从而影响山羊骨骼肌生长发育,与山羊肌肉的生长类型有关.同时序列分析显示,miR-27b在10个物种中具有较高的保守性.山羊miR-27b的表达具有的组织和时序差异性实验结果为进一步研究miR-27b的功能提供基础资料.     

西瓜CGMMV胁迫下MIR319家族成员及靶基因的鉴定分析

为明确MIR319家族成员(miR319、miR319a及miR319a-3p)在黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)胁迫应答中的作用,本研究将MIR319的成熟序列与西瓜基因组进行Blast比对获得其前体基因,利用MEGA对前体基因进行系统进化分析,PlantCARE对前体基因启动子区的顺式作用元件进行分析,降解组测序对MIR319的靶基因进行分析,转录组测序及qRT-PCR分析MIR319靶基因的表达模式。研究结果获得MIR319家族成员共同前体基因Pre-MIR319,其长度为170 bp,含有完整的茎环结构;序列比对显示,MIR319家族成熟序列在5'端第2~第14位碱基高度保守;西瓜Pre-MIR319与35个物种的116条miR319前体序列经系统进化分析后分为四个分支,其中西瓜Pre-MIR319与马铃薯miR319a前体基因(MI0025952)距离最近;Pre-MIR319启动子区含有光响应元件、赤霉素响应元件、乙烯响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、MYB和MYC等多个顺式作用元件;降解组测序获得MIR319家族成员的5个靶基因,其中Cla019567、Cla013523、Cla023342和Cla002428注释为TCP转录因子,Cla013668注释为MYB转录因子,剪切位点位于MIR319家族成员成熟序列5'端的第10位碱基;靶基因编码氨基酸数目为319~554 aa、分子量为34.94~61.21 kDa、理论等电点为5.29~7.80,定位于细胞核/细胞质中,均不含跨膜结构域;转录组测序及qRT-PCR分析表明miR319a负调控靶基因Cla013523(TCP)的表达。本研究结果进一步明确了MIR319家族成员在CGMMV胁迫应答中的作用及其对靶基因的调控作用。     

蝴蝶兰PhAG1b基因的克隆及在突变体花器官中的表达分析

为深入研究兰科植物花器官发育的调控机理,采用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰聚宝红玫瑰中克隆了一个C类MADS-box基因PhAG1b(GenBank登录号:KY475587),并分析了该基因在蝴蝶兰不同组织和5类突变体花器官中的表达水平。序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 250 bp,含完整的开放阅读框,编码234个氨基酸,包含MADS和K-box结构域及AG基序。系统进化树分析显示,该基因编码蛋白与木石斛的DcOAG1和建兰的CeMADS2一致性最高。转录表达分析表明,PhAG1b基因在营养器官中不表达,在花器官的萼片、侧瓣和唇瓣中也不表达,只在花器官的蕊柱和子房中表达,在授粉后的子房中表达水平降低;在退化雄蕊变异为花瓣的突变体花器官中,PhAG1b基因的表达水平没有变化;在侧萼和侧瓣变异为唇瓣的突变体中,PhAG1b基因在蕊柱中的表达水平明显降低,而在侧瓣退化与蕊柱合生和侧瓣顶端长出花药的突变花器官中,PhAG1b基因在蕊柱中的表达显著升高。由此可见,PhAG1b基因主要参与花器官中蕊柱和子房的发育调控,其功能可能与B类基因的功能互为消长。该研究结果为进一步探究兰科植物花器官发育的分子调控机理提供了依据。     

调控山羊乳腺脂肪酸代谢miRNAs筛选及相关pri-miRNAs克隆验证

microRNA(miRNA)是调控脂类代谢的重要分子。本研究采用数据库预测和自由能分析法,筛选与山羊(Capra hirus)乳腺脂肪酸代谢相关的miRNA,并对预测得到的miRNA进行克隆验证。预测结果表明,通过MicroCosm、TargertScan和PicTar3个在线数据库预测与山羊脂肪酸代谢相关的30个基因相对应的miRNA,预测得到50条miRNA,其中3个数据库预测一致的miRNA为13条,2个数据库预测一致的为37条。结果显示,脂肪酸合酶基因(FASN)对应4个不同的miRNA,嗜乳脂蛋白基因(BTN1A1)对应2个,而磷酸甘油酰基转移酶6基因(AGPAT6)没有预测到miRNA靶位点;FASN与BTN1A1的3’UTR上miR-103的结合位点分别有3个和2个。通过MFOLD软件对预测所得的50条miRNA靶位点两侧序列的自由能(ΔG>-20kcal/mol)进行分析,9种miRNA与调控脂肪酸代谢基因相关度较高,分别为miR-103/BTN1A1、miR-15/FASN、miR-23/LPL(脂蛋白酯酶)、miR-27/PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体)、miR-29/GPR41(短链脂肪酸受体)、miR-146/BTN1A1、miR-195/FASN、miR-200/SCD(硬脂酰辅酶A去饱和酶)和miR-497/GPR41,其中miR-103/27/195分别位于BTN1A1、PPARγ和FASN的靶位点与已知物种间同源性较高,增加了这些miRNA/mRNA结合的可能性。此外,靶位点单侧和双侧ΔG小于阈值的miRNA/mRNA分别为14对和9对,其中miR-27/mRNA预测的靶基因为4个,依次为FASN、ACOX1(乙酰辅酶氧化酶基因1)、LPL和PPARγ,miR-103和miR-15的靶基因同为FASN、BTN1A1和ACOX1。以西农萨能奶山羊(Capra hirus)基因组DNA为模板,可扩增出与5条miRNA(miR-103-1/23a/27a/146b/200a)分别相对应的初级miRNA(pri-miRNA);通过序列分析和二级结构分析表明,5条pri-miRNA均包含完整的pre-miRNA序列,同时具有典型的茎环结构,能够产生相应的miRNA。与牛的同源性分析表明,除pre-miR-27a同源性为98%外(山羊pre-miR-27a3’端第11个碱基为G,而牛为A),其余4条pre-miRNA同源性均为100%。因此,本研究筛选的9种miRNA可能调控山羊乳腺脂肪酸代谢,克隆的5条pri-miRNA为其功能研究提供基础。     

鸡miR-124a-3p的组织表达谱及其与ACAA2基因的互作关系

鸡(Gallus gallus)miR-124a-3p与乙酰辅酶A酰基转移酶2基因(acetyl-CoA acyltransferase 2 gene,ACAA2)间存在潜在的互作关系。但目前对鸡miR-124a-3p的功能及其与ACAA2的靶作用关系了解还很少。本研究整合了组织表达谱和靶基因预测结果,分析鸡miR-124a-3p的潜在生物学功能,并验证了其与ACAA2的靶向关系。qRT-PCR结果显示,miR-124a-3p在所检测的鸡4个发育阶段13种组织中均表达,尤其是在下丘脑中高丰度特异性表达。生物信息学分析显示,miR-124a-3p预测靶基因在脂类转运、神经元迁移调控、脂肪细胞因子信号通路、轴突导向等生物学过程和通路中富集。关联分析表明,miR-124a-3p和ACAA2在胸肌、肝脏和皮下脂肪组织中的表达呈负相关。在鸡成纤维细胞中转染miR-124a-3p模拟物(miR-124a-3p mimics)可显著抑制荧光素酶活性和ACAA2的表达,表明鸡miR-124a-3p为一广泛性表达miRNA,且呈明显的时序表达,并通过靶作用于ACAA2参与多种脂类代谢相关生物学过程调控。本研究数据为进一步研究鸡miR-124a-3p功能和揭示鸡脂肪沉积相关性状形成机制提供了资料。     

Inhibition of diphenolase activity of tyrosinase by vitamin b(6) compounds

The vitamin B(6) compounds pyridoxine (PN), pyridoxamine (PM), pyridoxal (PL), and pyridoxamine 5'-phosphate (PMP) inhibited the diphenolase activity of mushroom tyrosinase. PM showed the highest inhibition; the control activity was inhibited by 38% at 1.5 mM. Each PL, PN, and PMP showed about 30% inhibition at the same concentration. Lineweaver-Burk plots showed that PM and PN were mixed-type inhibitors with K(I) values of 4.3 and 5.2 mM, respectively. Because PM and PN cannot form a Schiff base with a primary amino group of the enzyme, their inhibition is not attributable to the formation of the Schiff base. Alternatively, their quenching function of reactive oxygen species (ROS) was postulated to be responsible for the inhibition. Thus, the inhibitory effect of ROS was examined. The representative singlet oxygen quenchers l-histidine, sodium azide, Trolox, and anthracene-9,10-dipropionic acid (AAP) inhibited the activity. The specific scavenger of superoxide, proxyl fluorescamine, also inhibited the activity. The scavengers of hydroxyl radical, d-mannitol and dimethyl sulfoxide, showed no inhibition. The fluorescence of AAP was decayed during the diphenolase reaction, and PM inhibited the decay. AAP was also a mixed-type inhibitor. The results showed that the vitamin B(6) compounds inhibited the diphenolase activity by quenching ROS (probably singlet oxygen) generated during some reaction step of the diphenolase reaction.     

基于常规Olsen法的全自动化学分析仪(SmartChem 200)测定土壤有效磷的研究

土壤有效磷含量在评价土壤肥力、指导作物磷肥施用等方面有重要的意义。常规测定方法(碳酸氢钠浸提-人工钼锑抗比色法)步骤复杂、费时费力,提高常规方法测试效率和准确性是测土配方施肥研究中亟待解决的技术问题。选取4组不同有效磷含量的土壤为样品,探究基于碳酸氢钠浸提-全自动化学分析仪测定土壤有效磷含量的可行性。结果表明:此方法有效磷含量在0.00~2.00 mg/L范围内线性良好,相关系数r为1;用于测定土壤样品中有效磷含量,测定结果与常规方法接近,相对误差在0.00%~2.07%之间,有较高的相关性;用于测定土壤标准物质(NSA-2)中有效磷,测定结果的相对标准偏差(RSD,n=6)为0.37%,加标回收率为99.00%~101.00%。采用全自动化学分析仪测定土壤有效磷准确度高、精密度好,测定结果达到土壤有效磷的检测要求;同时该仪器操作简单、测试效率高,可用于大批量土壤有效磷含量的分析测试。     

用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得

用水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．）的幼胚、愈伤组织作受体,采用ＰＩＧ基因枪法,成功地将苏云金杆菌毒蛋白基因〖Ｂｔ毒蛋白基因,ｃｒｙＩＡ（ｂ）〗和马铃薯蛋白酶抑制剂基因（ｐｉｎⅡ基因）连同抗除草剂Ｂａｒ基因分别转入不同的水稻中,获得大量的转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交分析途中外源抗虫基因均分别整合到水稻的基因组中。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析显示它们在水稻叶片中表达的水平较高。外源基因在一代中遵循３     

Evaluation of Phenol/Aniline (Single and Binary) Removal from Aqueous Solutions onto Hyper-cross-linked Polymeric Resin (Macronet MN200) and Granular Activated Carbon in Fixed-Bed Column

This work was conducted to evaluate the sorption performance of hyper-cross-linked Macronet resin (MN200) compared to the granular activated carbon in order to remove phenol and aniline from aqueous solution in both single and binary solutions. Fixed-bed column experiments were used to obtain the breakthrough curves. The experimental data were fitted to the Thomas, Bed Depth Service Time and Yoon?CNelson models, well-established fixed-bed sorption models. The theoretical sorption capacities obtained by the Thomas model were in good agreement to the breakthrough capacities determined from the sorption data. The sorption capacity decreased in binary sorption for resin MN200, while activated carbon reported similar (aniline) or higher (phenol) sorption performance indicating a synergistic effect between both solutes on the activated carbon surface. A good prediction of the breakthrough curves in binary solution was obtained by using an approach that considers a simple model to describe a breakthrough curve (Thomas) and modified isotherm equilibrium. The resin MN200 fixed-bed columns were easily regenerated by using a methanol solution, reporting more above of 90% of recovery for both solutes, while about 50% was the recovery of activated carbon after single experiments. The regeneration after the binary sorption experiments reported a decrease in the solute recovery, effect that was especially evident for activated carbon.     

Evaluating Binary Sorption of Phenol/Aniline fromAqueous Solutions onto Granular Activated Carbon and Hypercrosslinked Polymeric Resin (MN200)

Sorption equilibrium of phenol and aniline onto the granular activated carbon and hyperreticulated un-functionalized polymeric resin (MN200) was investigated in single and binary component aqueous systems. Higher loading was obtained for aniline than phenol onto both sorbents, which is probably due to hydrophobic difference between both solutes and the greater electronic density of the aromatic ring of the aniline. Granular activated carbon reported larger uptake than resin MN200 for both solutes, which may be attributed to the better physical properties of the granular activated carbon, for instance, larger surface area. The experimental sorption could be properly described by the Langmuir and Freundlich isotherms. Five models for predicting the binary equilibrium sorption isotherm were compared in order to determine the best fit model to correlate binary experimental data: the extended Langmuir isotherm with and without a constant interaction factor, a simplified model based on the single equilibrium factors, the empirical extended Freundlich isotherm and the modified extended Langmuir equation, which considers the synergistic interactions between sorbate–sorbate and not only the competition between them defined by the extended Langmuir model. The modified extended Langmuir model provides the best agreement between predicted and experimental data indicating that the synergistic interactions between solutes play an important role in the binary phenol/aniline sorption system.     

水貂细胞色素b基因(Cytb)克隆、序列分析及与鼬属动物的进化关系

参照水貂(Mustela vison)近缘物种线粒体基因组序列设计引物,通过克隆、测序、再拼接的方法获得6个水貂品种和左家型水貂线粒体Cytb基因全序列.用DNAstar v6.13和DnaSP4.0分析显示,水貂Cytb基因全长为1140 bp,平均碱基含量为29.8%A、13.0%G、30.3%T及26.9%C,检测到12个多态位点,全为转换.用Clusta1X1.8进行多序列比较分析表明,水貂个体间Cytb基因相似性非常高.结合GenBank检索到的14种鼬属动物同源序列,用MEGA4.0基于邻接法分别构建鼬属动物核苷酸序列和氨基酸序列系统进化树,两种进化树得出相似的拓扑结构.结果表明:我国水貂与美洲水貂亲缘较近,与欧洲水貂(M.lutreola)亲缘较远,推算美洲水貂与欧洲水貂分歧时间在中新世.