牛巨噬细胞天然抗性蛋白Ⅰ基因可变剪接体(NRAMPI-ISO)的克隆及在细胞和组织中的表达

巨噬细胞天然抗性蛋白1 (NRAMP1)可抑制结核分枝杆菌(Mycobacterium)和布氏杆菌(Brucella)等多种胞内寄生病原菌的感染,提高动物机体的抗病能力.本研究从秦川牛脾脏中克隆了NRA MP1基因的一种可变剪接体NRA MPI-ISO,序列分析表明,NRA MPI-ISO比NRAMP1多了第3个内含子,从而导致编码序列提前终止于第3个内含子,NRA MPI-ISO编码200个氨基酸.为了探索可变剪接体NRAMPI-ISO的表达情况,本研究分别构建了原核表达载体pET-41-NRA MPI-ISO和真核表达载体pEGFP-NRA MPI-ISO.原核表达载体pET-41 -NRA MPI-ISO可在不同浓度的IPTG诱导下在大肠杆菌BL21中高效表达.真核表达载体pEGFP-NRA MPI-ISO转染牛成纤维细胞后,EGFP-NRAMP 1-ISO融合蛋白分布在细胞核和细胞质中,而正常的NRAMP1蛋白只分布在细胞质的溶酶体膜周围.半定量RT-PCR检测表明,NRA MPI-ISO基因在心、脾脏、肺脏等组织有较高的表达,而在脑、胰、生殖嵴中的表达量相对较低.本研究为进一步研究NRA MPI-ISO基因生物学功能提供了重要信息.     

秦川牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)N端序列的原核表达及纯化

为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能,探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因,本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列,并将其克隆到pMD18-T simple载体,酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体,命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp1-N融合蛋白表达,并筛选最佳诱导条件,用谷胱甘肽Sepharose4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,牛Nramp1N端编码序列长186bp,与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异,致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1N端表达重组质粒pGEX-N2,于35℃、0.1mmol/LIPTG、诱导10h,在大肠杆菌中高效表达,表达产物的分子量为33kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。     

腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因(SREBP2)过表达载体的构建与鉴定

固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM₀01205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达.     

广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。     

奶牛γ-干扰素基因的克隆及其在COS-1细胞中的表达

应用RT—PCR技术从经体外植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出牛γ-干扰素(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)基因。将扩增出的BovIFN-γ克隆到PMD18-T载体中,经过限制性酶切分析筛选正向插入的克隆。测序结果表明,所克隆到的基因编码区序列与已报道基因存在3个核苷酸的差异。将该基因片段从PMD18-T载体中用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3．1／zeo ( )中,构建真核表达载体pcDNA—BovIFN-γ,通过脂质体转染COS-1细胞,用鼠抗BovIFN-γ高免血清和FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光实验(IFA)检测,结果表明,在COS—1细胞的细胞膜和胞浆内均有rBovIFN-γ表达,细胞病变抑制实验证实,转染后细胞培养上清液具有一定的干扰素活性,转染后72h细胞培养上清液在MDBK细胞上抑制VSV病毒的效价可达到128IU／mL。研究结果为进一步筛选稳定表达BovIFN-γ基因细胞系、开发奶牛疾病预防控制的新产品以及开展奶牛疾病的基因治疗奠定了基础。     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

牛MEN1基因真核表达载体的构建及其表达分析

多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P＜0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系.     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

枯草芽孢杆菌群β-甘露聚糖酶基因克隆及同源性分析

本文对33株枯草芽孢杆菌群菌株进行β-甘露聚糖酶活性筛选,其中的32株具有β-甘露聚糖酶活性,只有1株无β-甘露聚糖酶活性。通过基因克隆测序的方法获得33株枯草芽孢杆菌群菌株β-甘露聚糖酶基因编码区全序列,对酶基因进行同源性分析并构建系统发育树;在β-甘露聚糖酶基因系统发育树中,33株枯草芽孢杆菌群菌株聚为3个分支,分别是枯草芽孢杆菌分支、地衣芽孢杆菌分支和解淀粉芽孢杆菌分支;枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因种内同源性大于91％,而种间同源性为60％～69％。     

牛支原体pdhα和pdhβ基因的克隆、原核表达及亚细胞的定位

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病.丙酮酸脱氢酶复合体E1 (pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化.本研究参照GenBank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα (GenBank登录号:KU355295)及pdhβ基因(GernBank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR (Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒pET-pdhα和pET-pdhβ.表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropy1β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E 1α亚基融合蛋白PDHA及PDHcE1β亚基蛋白PDHB.纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHcE1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究.结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白rPDHA及rPDHB的分子量分别约为40和37kD,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当.本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料.     

水牛促卵泡素受体(FSHR)基因5′端侧翼序列的克隆与分析

促卵泡素(FSH)是动物脑垂体分泌作用于卵巢卵泡生长、发育、分化、成熟和排卵的重要繁殖激素。由于是生物大分子,不能透过细胞膜,FSH必须与靶细胞膜上的促卵泡素受体(FSHR)结合,经过受体介导将信息传递到靶细胞内,才能发挥其生物学功能。目前国内外已对牛、山羊等多种动物的FSHR基因的cDNA序列进行了克隆测序,但是关于水牛FSHR基因5′端侧翼序列还未见报道。本研究对水牛FSHR基因5′端序列进行克隆和序列分析,其目的是寻找水牛FSH受体基因的SNP突变位点,从而为以后进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在水牛繁殖中的可能作用打下基础。由水牛血液中提取DNA,与根据牛FSH受体基因序列设计的特定引物进行PCR反应,以合成FSHR 5′端侧翼调控区,扩增的该片断经分离、回收和纯化后再插入到pMD18-T质粒中,筛选阳性克隆,将插入了FSHR 5′端侧翼端片断的质粒纯化后进行序列测定和分析,弄清核苷酸序列和假定的氨基酸顺序并通过GeneBank进行同源性分析。结果表明,PCR扩增获得的片段为939 bp,与中国西门塔尔牛该段序列相比,同源性为97.44%,在-720 bp处的1个碱基缺失;与山羊的FSHR基因比较,同源性为94.78%,在-625~-619 bp处有7个碱基的插入;在此激素反应元件3′端一段序列(-530~-526 bp)水牛和山羊的相同均为TGACC,而西门塔尔牛为CGACC,但三者5′端一段序列(-679~-675 bp)没有突变并且相同,均为GGTCA;与人和大鼠FSHR基因不同的是,在牛、水牛和羊的FSHR基因启动子区检索出了TATA盒基元和多个类CAAT盒序列,且在水牛、山羊和牛之间没有碱基差异。因此,对水牛FSHR基因转录启动和表达调控值得进一步研究。     

通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定

利用DNA同源重组(基因打靶)技术对动物基因组进行遗传修饰是转基因研究的重要手段之一。本研究以pEGFP-C1载体为载体骨架,成功构建了包含两个多克隆位点、两个同向LoxP(locus of crossing-over(x)in P1)序列和正负筛选标记基因的通用型打靶载体pGT-C1。正筛选标记新霉素磷酸转移酶基因(Neo)和水母绿色荧光蛋白基因(AcGFP)在两个LoxP序列之间;负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk和两个多克隆位点序列分别在两个LoxP序列外侧。经双酶切和测序证明载体构建成功后,转染胎牛成纤维(fetal bovine fibroblast,FBF)细胞,利用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)分别对正负筛选标记进行功能验证;随后将Cre重组酶表达载体转染阳性FBF细胞,用半定量PCR检测Cre-LoxP系统的切割效率;最后构建针对牛(Bos taurus)β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并在转染药筛后对其打靶功能进行检测。打靶载体pGT-C1具有以下优点:包含两个多克隆位点,方便长短同源臂的定向插入,极大提高了该载体的通用性;位于两个同向LoxP之间的绿色荧光标记基因AcGFP可实时监控载体的转染效率和整合效率,还能依据荧光表达筛选去除筛选标记的阳性细胞,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响,为高效基因打靶提供了保证。综上所述,本研究成功构建了更加实用、有效的通用型打靶载体pGT-C1,以及针对牛β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并成功获得了转基因牛成纤维细胞单克隆,为转基因动物模型的建立提供了基础工具。     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

奶山羊短链脂肪酸受体基因(GPR43)编码区(CDS)的克隆及表达分析

GPR43是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)家族成员之一,在脂代谢中具有潜在的调控作用。本实验旨在克隆奶山羊(Capra hircus)短链脂肪酸受体基因GPR43编码区(coding sequence,CDS)并分析其组织表达谱。根据GenBank上已登录的牛(Bos taurus)GPR43基因(NM_001163784)序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆奶山羊GPR43基因的编码区(coding sequence,CDS)(GenBank登录号:HM623658),测序结果分析表明,该基因CDS区长度为987 bp,共编码329个氨基酸。序列同源性分析表明,奶山羊GPR43的核苷酸和氨基酸序列与牛、人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)的相似性较高,且与牛的相似性高达90%以上。蛋白结构预测发现,奶山羊GPR43蛋白具有7个跨膜螺旋,且C端存在较强的疏水区域,N端则表现出较强的亲水性。实时定量PCR分析表明,在干奶期奶山羊的10个组织中,GPR43基因在脾脏中表达量最高,小肠、肝脏、脂肪次之,肺脏、肌肉和肾脏表达相对最少,而乳腺中也有少量的表达,表明其具有明显的组织表达特异性。泌乳期奶山羊GPR43基因的表达显著高于干奶期,表明该基因在奶山羊泌乳组织中具有一定的调控作用。研究结果为进一步揭示GPR43在奶山羊乳腺组织的功能提供参考资料。     

鸭PPARs启动子扩增、序列比较及其转录因子表达模式的聚类分析

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是核激素受体超家族的一员,分α、β/δ、γ3个亚型,是调节细胞生长和分化的重要因子.为了解PPARs各成员在鸭(Anas platyrhynchos)骨骼肌发育中的不同作用,本研究克隆了鸭PPARα、PPARβ和PPARγ基因启动子区,预测其共同转录因子结合位点,用qRT-PCR检测PPARs及共同转录因子在鸭胚及出生后骨骼肌发育过程中的表达,比较表达模式并进行聚类分析.结果表明,扩增出鸭PPARα、PPAEβ和PPARγ启动子序列分别为2 526、1 631和2 942 bp,GenBank登录号分别为KX845431、KX845432和KX845433.鸭PPARs启动子区存在典型的CAAT-box、TATA-box顺式作用元件,预测存在共同的特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein alpha,C/EBP-α)转录因子结合位点.PPARs成员在鸭胸肌、腿肌组织中均有表达.在胸肌中,转录因子NF-κB与PPARβ基因的表达模式一致;在腿肌中,Sp1、NF-κB、PPARβ和PPARγ的表达模式一致.PPARs各成员均参与了骨骼肌的发育调控,PPARβ作用可能更大;PPAPβ、PPARγ在鸭骨骼肌发育过程中的功能可能相似;此外,NF-κB可能调控PPARβ在骨骼肌中的表达.研究结果为PPARs基因的表达和功能鉴定提供理论依据.     

河南良杂猪白细胞介素18基因的克隆及其成熟蛋白在大肠杆菌中的表达

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)又称为干扰素γ诱生因子(interferon gamma inducing factor,IGIF).Okamura and Tsutsui(1995)首次从中毒性休克的鼠肝脏中克隆出了该因子.Muneta et al.(1999,2000)从猪肺泡巨嗜细胞中克隆到pIL-18,并证明表达pIL-18的成熟蛋白比前体蛋白具有更高的活性.本研究选择河南省普遍喂养的良杂猪,对其IL-18基因进行扩增及序列测定,并实现了成熟蛋白在大肠杆菌中的初步表达.     

奶山羊超长链脂肪酸延伸酶6基因(ELOVL6)的克隆及其对4个脂肪酸代谢基因表达水平的影响

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)是长链脂肪酸延长反应的限速酶。本研究旨在通过对奶山羊(Capra hircus)ELOVL6基因的克隆、组织表达分析以及腺病毒(Adenovirus)介导的超表达技术,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响。利用RT-PCR技术克隆了奶山羊ELOVL6基因的CDS区;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在泌乳期奶山羊10个组织中的相对表达量;构建该基因的重组腺病毒超表达载体,包装出高滴度的腺病毒并感染奶山羊原代乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测ELOVL6超表达效果及其对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明,ELOVL6基因CDS区序列长度为795 bp(GenBank登录号:KF667508),共编码264个氨基酸。同源分析发现,奶山羊ELOVL6基因CDS区核酸序列与牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)和人(Homo sapiens)的同源性分别为97%、90%和93%,氨基酸序列同源性分别为99%、92%、95%。利用TMpred对ELOVL6蛋白跨膜结构预测分析,发现该蛋白有5个跨膜区,保守的组氨酸模体(HXXHH)位于ELOVL6蛋白的第二与第三跨膜螺旋间。ELOVL6蛋白质疏水性预测显示,该蛋白总体具有较强的疏水性。组织表达分析显示,ELOVL6基因在脂肪组织中表达量最高(P0.01),小肠次之(P0.01),心脏中表达量最低。超表达ELOVL6基因的重组腺病毒的滴度为108U/mL,病毒液感染原代乳腺上皮细胞48 h后,ELOVL6基因的表达量上升约200倍;脂肪酸代谢相关基因检测分析发现,固醇调节元件结合蛋白-1基因(SREBP-1)的表达量显著下降(P0.05),脂肪分化相关蛋白基因(ADRP)的表达量显著升高(P0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARγ)及脂肪酸转位酶基因(CD36)的表达量无明显变化。研究结果表明,ELOVL6基因可以影响奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢相关基因的表达,对乳腺脂肪酸代谢具有一定的调控作用。本研究为ELOVL6基因在奶山羊乳腺脂肪酸代谢调控中的功能研究提供研究依据。     

二穗短柄草MADS-BOX基因AGL6和FUL1的可变拼接和表达模式分析

MADS-BOX基因家族是一类调控植物发育的重要转录因子,AGAMOUS LIKE 6(AGL6)和FRUITFULL(FUL1)属于其亚家族。本研究克隆了二穗短柄草(Brachypodium distachyon)2个MADS-BOX基因Bd AGL6和Bd FUL1的c DNA序列,分析了这2个基因的可变拼接和表达模式。结果表明,Bd AGL6基因在转录过程中,由于内含子部分保留机制,发生可变拼接,形成了3个转录本(Bd AGL6-1、Bd AGL6-2和Bd AGL6-3);Bd AGL6-3与水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea maize)等禾本科植物中的AGL6转录因子序列高度同源;和Bd AGL6-3相比,Bd AGL6-1在C末端结构域插入额外的7个氨基酸;Bd AGL6-2在C末端结构域插入额外的5个氨基酸。q RT-PCR结果显示,Bd AGL6在花中高水平表达,其中Bd AGL6-3表达最强,Bd AGL6-1和Bd AGL6-2表达较弱。Bd FUL1基因的前体m RNA同样发生了可变拼接,产生2个转录本(Bd FUL1-1和Bd FUL1-2);两者的表达模式相似,除了在花和茎中表达之外,在幼苗的叶中也有表达。研究结果为进一步了解MADS-BOX基因家族的生物学功能提供了参考资料。