波尔山羊胚胎移植技术的研究与应用

分三批使用阴道栓+FSH超数排卵供体波尔山羊13只.在放入阴道栓的第8～10天,连续3天递减量肌肉注射FSH(澳大利亚)320mg.9只供体羊发情、配种、采胚(有效率69.23%,9/13),平均采胚数18.11±5.18枚,其中可用胚平均数15.44±6.31枚(可用胚率85.28%,139/163).将139枚7日龄可用胚移植受体关中奶山羊89只,妊娠50只,妊娠率56.18%.其中鲜胚移植妊娠率61.11%(44/72),冻胚移植妊娠率41.67%(5/12),二分割胚移植妊娠率20%(1/5).50只妊娠受体羊共产羔68只,每只供体羊平均获羔羊7.56只.供体羊采胚后,平均39.9d发情,配种,全部妊娠产羔,平均产羔2只.胚胎移植羔羊性别、初生重、发病率和波尔山羊自繁羔羊无显著差异(P＞0.05).     

季节对羊同期发情和胚胎移植效果的影响研究

采用放置CIDR栓结合激素处理的方法,对204只供体和受体羊分别在冬季和春季进行同期发情处理和胚胎移植试验。结果表明,供体羊只冬季的发情率为90.9%,显著高于春季的发情率75.0%(P ＜ 0.05);受体羊冬季的发情率84.0%,显著高于春季的发情率76.4%(P ＜ 0.05)。季节对供体母羊超数排卵个数、可利用卵子个数及卵子回收率均有不同影响,冬季供体羊只可利用卵子个数高于春季;冬季卵子回收率85.3%,显著高于春季的67.4%(P ＜ 0.05)。季节对受体母羊受胎率和繁殖率均有不同的影响,冬季受体羊的受胎率65.0%和春季受体羊的受胎率60.0%差异不显著(P ＞ 0.05);冬季受体羊的繁殖率达到100.0%,显著高于春季受体羊的繁殖率82.0%(P ＜0.05)。     

脂质体法构建广西巴马小型猪转基因体细胞及转基因克隆胚的生产

脂质体法是一种传统的向哺乳动物细胞导入外源基因的方法,然而其转染效率受多种因素影响。本研究将从脂质体和质粒DNA量、转染暴露时间以及混合孵育时间等四方面进行探索,以寻找最佳的转染体系。试验结果表明最佳转染体系为：脂质体1.25μL、DNA 0.7μg、脂质体-DNA混合孵育0 min以及转染暴露6 h。随后我们用优化过的转染体系对新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞进行转绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）操作,获得了（26.45±2.11）%的转染率,并以此为核供体经体细胞核移植技术成功构建表达GFP的广西巴马小型猪克隆胚胎,同时证实转基因克隆胚的体外发育能力比得上非转基因克隆胚。这为我们构建用于人类疾病研究的基因修饰广西巴马小型猪奠定了基础。     

供体细胞和曲古抑菌素(TSA)对奶牛克隆胚胎发育的影响

本研究探讨供核细胞处理策略(新鲜消化、-196℃冻存组(复苏后)和曲古抑菌素(TSA)处理组)和TSA-CR1aa胚胎培养液处理时间对克隆胚发育的影响。利用体细胞核移植技术生产奶牛克隆胚胎,将部分克隆胚移植给自然发情同步的受体,检验克隆胚的体内发育能力。结果显示:TSA处理体细胞组的克隆胚卵裂率和囊胚率与新鲜消化和-196℃冻存组相比差异显著(P<0.05);-196℃冻存组与新鲜消化组差异不显著;用TSA-CR1aa分别处理新鲜消化细胞构建的克隆胚0、24、48和60h,其中,60h处理组的囊胚率最高(36.11±1.78%)与其他组对比差异显著(P<0.05);用TSA-CR1aa分别处理TSA处理组构建的重构胚24、48和60h,结果发现,60hTSA-CR1aa处理组囊胚率(37.39±1.78%)最高,显著高于24h(25.48±1.34%)TSA-CR1aa处理组,且差异显著(P<0.05)。将所获得的克隆胚胎分别移植给40头自然发情的受体母牛,并观察移植25,45,65和90d后的返情情况,结果显示,各组受孕率无统计学差异,但经TSA处理细胞和胚胎组移植的受体中,获得一头存活的体细胞克隆奶牛。说...     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚。研究结果表明,成熟44h的卵母细胞核移植后有较高的融合率（58.99%）、卵裂率（67.52%）和囊胚率（22.78%）,而成熟48h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞的分裂率与囊胚率（P〈0.05）。卵龄为48h的卵母细胞融合率高于卵龄为52h卵母细胞的融合率（P〈0.05）。同时我们还探讨了不同去核方法（盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system）对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响。研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%。Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率（P〉0.05）,而与Spindle-view法去核率没有差异（P〉0.05）。三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著（P〉0.05）,但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著（P〈0.05）。进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著（P〈0.05）;两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考。     

奶牛X性控冻精应用研究

利用SX-MOFLO精子分离设备分离奶牛XY精子,将分离后的奶牛X精子冷冻保存。探讨奶牛X性控冻精解冻后存活时间、不同方法进行人工授精的受胎率,为奶牛X性控冻精的大规模推广应用提供依据。方法与结果:(1)取不同种公牛、不同批次的X性控冻精及普通冻精解冻后倒入5 mL试管内摇匀,至37°C水浴锅中,每2 h检测一次精子活力,4 h后每小时检测一次精子活力,直至无运动精子。结果奶牛X性控冻精存活时间为5~12 h,比同种普通精子的存活时间短2~10 h。(2)应用奶牛X性控冻精人工授精的母牛的情期受胎率(59.4%=342/576)与普通冻精的情期受胎率(60.6%=129/213)相比,无显著差异(P>0.05)。奶牛X性控冻精母犊出生准确率93.3%(319/342),极显著地高于普通冻精48.8%(63/129)的母犊率(P<0.001)。且应用奶牛X性控冻精人工授精后的青年牛的情期受胎率(6 5.6%=2 4 0/3 6 6)极显著的高于经产牛的情期受胎率(4 8.6%=1 0 2/2 1 0)(P<0.001)。(3)在母牛发情结束后6~8 h左右进行人工授精,其情期受胎率为67.1%(116/173),显著地高于在母牛发情开始后8~1 2 h进行人工授精5 6.1%(2 2 6/4 0 3)的情期受胎率(P<0.0 1)。(4)在准确判断母牛卵巢上卵泡发育状态的前提下,将精液全部输至发育侧子宫角大弯处,其情期受胎率62.7%(289/461),高于母牛每侧子宫角输1/2支X性控冻精46.1%(53/115)的情期受胎率,但二者之间差异不显著(P<0.05)。研究结果表明应用奶牛X性控冻精进行人工授精,其受胎率与奶牛的经产与否、授精时间和输精部位有关。     

马齿形玉米种子尖端激光定向与胚面识别装置研制

为了实现玉米种子的尖端定向与胚面识别,该文以现有尖端定向装置输出的马齿型玉米种子为对象,基于激光开关和测距原理,提出了一种尖端定向与胚面识别方法:依据马齿形玉米种子尖端窄大头宽的轮廓特征,利用激光开关传感器等部件对玉米种子的尖端朝向进行识别,并将大头朝前的玉米种子进行剔除;依据马齿形玉米种子胚面上有胚沟而反面较为平整的表面特征,利用激光测距传感器等部件对尖端朝前的玉米种子进行胚面识别。设计并搭建了玉米种子尖端定向与胚面识别装置,配合现有的尖端定向装置进行试验,结果表明:尖端定向与胚面识别装置的尖端定向成功率达到99.1%,相比现有的尖端定向装置提升了9.5个百分点,胚面识别准确率为96.4%。该方法基本可以实现玉米种子的尖端定向,同时保证胚面识别准确率达到较高水准。该文提出的玉米种子尖端定向与胚面识别方法可为后续玉米种子的自动化定向包装提供参考。     

黄牛和水牛种间核移植研究初报

本实验探讨了将体外培养成熟的水牛卵母细胞去核后 ,作为体外受精生产的黄牛胚胎细胞核移植的受体进行种间核移植的可能性。结果表明 ,黄牛与水牛进行种间核移植的重组卵有 54.2 %的融合率 ,显著地低于黄牛种内核移植的结果 ( 75.0 % ,P<0 .0 5) ;而卵裂率两者之间差别不大 (分别为 65.4 %和 71 .2 % ,P>0 .0 5)。但来自种间核移植的早期胚胎体外发育潜能很低 ,体外囊胚发育率只有 5.9% ,很显著地低于种内核移植的结果 ( 50 .0 % ,P<0 .0 1 )。用作种间核移植受体的体外成熟水牛卵母细胞质量较差可能是造成重组胚体外发育能力低的主要因素之一。     

绵羊同期发情及冻胚移植效果观察

羊胚胎移植技术是优秀种羊扩群和引种的有效手段。在绵羊繁殖季节采用两种同期发情处理方案对150只受体羊处理,同期发情率为88.67%(133/150)。采用手术法,对其中126只受体羊进行了纯种肉羊冻胚移植,受体羊可用率为94.74%(126/133)。用B超诊断妊娠率为44.00%(55/125),产羔59只,单羔存活率93.62%(44/47),双羔存活率66.67%(8/12)。试验结果表明,用冷冻胚胎移植繁殖种羊可行。     

兰州百合和大花卷丹远缘杂交胚挽救技术研究

利用兰州百合与大花卷丹进行正反交,研究了花期调控、不同授粉方式、蒴果采收时间及胚挽救培养基配方对杂种胚萌发率及成苗率的影响。结果表明,兰州百合延后种植及大花卷丹提前种植,可有效地解决花期不遇的问题;兰州百合与大花卷丹杂交授粉时,花期授粉的蒴果膨大率可达93.3%,种子有胚率为2.00%;大花卷丹与兰州百合杂交授粉时,切割柱头的授粉膨大率最高,仅为7.6%,但种子有胚率为0%。兰州百合与大花卷丹杂交授粉后60～70 d的蒴果进行胚培养较为适宜。兰州百合与大花卷丹的杂交胚适宜培养基为MS+0.3 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA。     

诱导幼羔卵泡发育及体外胚胎生产

本文研究了羔羊年龄、运输应激和重复超排对幼羔所获卵母细胞数量的影响,胚胎发育液中添加EDTA对幼羔体外胚胎发育能力的影响。结果表明：6～8周龄组幼羔超排的只均获卵数和可用卵数（60.8枚和58.2枚）显著高于12～14周龄组（27.3枚和26.0枚）（P<0.05）;运输应激不影响幼羔超排所获卵母细胞数量（P>0.05）,但重复幼羔超排会显著降低所获卵母细胞数量（P<0.05）。在胚胎发育液中加入10μmol EDTA可显著提高幼羔体外早期胚胎的发育能力（P<0.05）,并且将部分体外胚胎移植后成功产下健康后代。     

幼畜繁殖（JIVET）技术在性成熟前奶牛上的应用

本实验旨在建立高效的性成熟前奶牛幼畜繁殖(JIVET)技术体系.建立了有效的对性成熟前犊牛进行促性腺激素处理的方法,平均每只犊牛可获得卵母细胞31枚:卵母细胞在体外成熟和体外受精过程中,受精率达到63.2%,与成年牛(59.7%)差异不显著.胚胎体外培养后犊牛胚胎囊胚率达到31.6%,仍显著低于成年牛(48.0%).对3头同期发情受体母牛进行胚胎移植,其中2头受孕,1头完成全程妊娠,受孕率达到66.7%.     

从家兔早期胚胎分离ES细胞影响因素的研究

比较胚胎的不同处理方法,不同饲养层对兔胚胎内细胞团(ICM)贴壁和增殖的影响。结果显示:消化掉外层粘蛋白和部分透明带的胚胎96 h贴壁率(85.29%,29/34)较高,内细胞团生长良好;超排组胚胎的贴壁率和内细胞团(ICM)原代克隆率与自然发情组差异不显著(85.71%vs 88.06%,21.43%vs19.40%,P>0.05);与对照组(12.5%,3.13%)相比,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(M EF)和兔胚胎成纤维细胞饲养层(REF)上培养获得的呈聚集状生长ICM及ICM原代克隆率较高(P<0.01),M EF组和REF组差异不显著(54.1%,22.95%vs 51.92%,17.31%,P>0.05),但REF饲养层培养效果不稳定。研究结果表明,兔早期胚胎消化掉外层粘蛋白和部分透明带有利于胚胎内细胞团贴壁和增殖;超排处理不影响从兔胚中分离胚胎干细胞(ES);小鼠胚胎成纤维细胞饲养层能有效支持兔胚内细胞团的贴壁和增殖。     

我国奶牛胚胎移植和胚胎工程现状及“十一五”的重点研究领域

根据作者20多年从事奶牛胚胎移植研究与推广工作的实践，全面总结了我国奶牛胚胎移植和胚胎工程发展的历程及取得的主要成果，指出了目前存在的问题，提出了“十一五”重点研究领域。     

不同施肥模式对南方黄泥田耕层有机碳固存及生产力的影响

【目的】探讨南方丘陵黄泥田不同施肥对耕层土壤有机碳固存及生产力的影响,促进区域农田固碳减排和作物高产。【方法】基于32年的长期定位试验,研究不施肥(CK)、单施化肥(NPK)、化肥+牛粪(NPKM)、化肥+全部稻草还田(NPKS)处理下,历年水稻产量、代表性年份耕层土壤有机碳含量及固碳速率的变化。【结果】NPK、NPKM、NPKS处理下水稻历年平均产量分别较CK高67.1%、88.1%和84.2%,差异显著,且NPKM、NPKS处理与NPK处理间亦具有显著差异。NPK、NPKM与NPKS处理耕层土壤有机碳历年平均含量比CK高8.9%~36.8%其中NPKM最高且亦显著高于NPKS与NPK处理。与初始土壤相比各处理有机碳含量增加1.84~5.26g/kg。以每10年为评价周期,NPKM、NPKS处理的固碳速率与CK及NPK差异均显著,其中双季稻年份NPKM与NPKS处理固碳速率分别是CK的2.38倍和1.98倍,是NPK处理的1.59倍与1.32倍但NPK处理与CK间差异不显著。稻田系统年均有机碳输入与有机碳固存间存在极显著幂函数关系,施肥土壤有机碳含量变化与籽粒产量变化间亦呈极显著正相关。【结论】南方黄泥田化肥配施有机肥或配合秸秆还田较单施化肥稳步提升水稻产量。长期不施肥土壤有机碳仍可维持低幅度增长,随着土壤有机碳含量升高,固碳效率逐步降低。化肥配施有机肥或配合秸秆还田较单施化肥明显提高了土壤的固碳速率二者均是提高黄泥田生产力与固碳能力的双赢措施。     

牛体细胞核移植胚和孤雌激活胚的两步法体外培养

摘要：研究了牛体细胞核移植胚和孤雌胚在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示：牛孤雌胚在培养液BECMaa＋10％FBS中的囊胚发育率明显高于SOFaa＋10％FBS或TCM199＋10％FBS （16.5% ∶ 13.6% / 12.8%, P＜0.05）；而在SOFaa＋10％FBS中添加还原型谷胱甘肽（GSH）后，牛孤雌囊胚的发育率显著提高（18.5% ∶12.8%, P＜0.01）。成纤维细胞生长因子4（FGF4）或胰岛素添加进无血清SOFaa（含GSH）中，可明显提高牛体细胞核移植胚的囊胚发育率（8.7% / 9.3%∶5.5%, P＜0.05），血清存在时，这两种生长因子无明显作用。依据上述结果及牛早期胚胎的代谢特征，以SOF为基础液合成两组培养液分两步培养牛胚胎，即先用胚胎培养液Ⅰ（SOFnaa＋GSH＋EDTA＋insulin）培养72 h，然后换用胚胎培养液Ⅱ（SOFaa＋GSH＋5％FBS＋葡萄糖＋insulin）继续培养，与对照组（SOFaa＋GSH＋10％FBS一步培养）相比，牛孤雌胚和核移植胚的囊胚发育率都明显提高（22.3%∶18.5%; 15.0%∶11.7%, P＜0.01），说明两步法培养体系更符合牛早期胚胎不同发育阶段的代谢特征和营养需求，是一种适宜的牛胚胎培养方法。     

图像处理识别玉米品种的特征参数研究

该文以中国普遍种植的黄玉米为研究对象,通过对不同品种玉米籽粒数字图像信息的分析对比,发现玉米籽粒白色部分(胚部)与黄色部分(冠部)的面积、颜色等信息可以作为识别玉米品种的特征.采用基于支持向量机的遗传算法结合SPSS统计软件进行试验验证,得出玉米籽粒白色部分与黄色部分的面积比例、黄色部分的蓝色分量与饱和度在玉米品种识别方面具有显著价值.     

广东惠阳水稻种植中耕牛与小型拖拉机使用的能值比较

以能值理论方法为手段,从资源的投入和输出结构角度,对广东省惠州市惠阳区典型水稻种植户的耕牛和小型拖拉机这两种典型的农业驱动力产出系统的转化与生产效率,环境负载和可持续性进行比较分析与评价。研究表明：耕牛系统在单位面积水稻田上消耗的不可更新资源量是拖拉机系统的4.57倍;人力能值消耗是拖拉机系统的6.14倍。相对于拖拉机动力,耕牛产出动力处于较低的能量等级,其环境负载率(ELR)仅是拖拉机系统的24%,可持续能值指标(ESI)是拖拉机系统的4.25倍,但有巨大的优化空间和可能。而广东小型拖拉机系统产出驱动力的使用效率则稍高于典型65 kW拖拉机系统。从提高能值效率角度分析,减少耕牛系统生产过程中过多的人力投入,着力提高耕牛系统产出驱动力的利用效率比发展小型拖拉机系统更有潜力。生产过程中的人力投入和使用过程中的维护投入是农机驱动力产出系统不可忽视的能值投入项。     

不同施肥制度对黄泥田土壤酶活性及养分的影响

对连续施肥23年的黄泥田土壤酶及土壤养分因子进行了分析,探讨长期不同施肥条件对土壤酶活性及土壤肥力的影响.结果表明,与对照相比,不同施肥制度(化肥、化肥+牛粪、化肥+秸秆回田)下土壤有机质增幅达19.5%～47.1%,氮素增幅达20.6%～47.9%,磷素增幅达36.7%～499.0%,钾素增幅达55.8%～80.0%.施肥提高了土壤脲酶、过氧化氢酶、转化酶和磷酸酶的活性,其中有机无机肥配施增幅达10.3%～28.6%.土壤有机质和养分含量与部分酶活性存在极显著或显著的相关性.表明黄泥田土壤酶活性与土壤肥力密切相关,可作为评价土壤肥力性状的生物学指标.