海南岛淡水鱼类eDNA宏条形码COⅠ通用引物的筛选

已知的鱼类环境DNA (environmental DNA, eDNA)宏条形码通用引物主要位于线粒体核糖体基因区，这些12S和16S引物存在部分近缘鱼类无法识别及参考序列不足等问题。本研究以海南岛淡水鱼类为调查对象，基于8目26科101属150种鱼类COⅠ序列，筛选出6个侧翼保守区；综合碱基变异、物种鉴定、eDNA降解及高通量测序读长需求，在4个侧翼保守区设计了26条引物，其中6条引物未达到Premier评分要求；72种海南淡水鱼类的首轮PCR结果显示，有11条引物的通用性较高，其中，PCR成功种数≥70且条带亮度均大于marker的引物有5条；次轮PCR结果显示，5条引物相互搭配产生的3 (正向) × 2 (反向)套引物组合的扩增成功率均为100% (72种/72种)，经PCR条带长度、亮度筛选后表现最优的引物组合为“HN-A-F4、HN-D-R3”(以下简称HN-COⅠ)。30个水样高通量测序结果显示，HN-COⅠ产生的待分析序列总数、鱼类序列总数、OTUs总数和鱼类OTUs总数分别为MiFish-U的0.77倍(8 919 976/11 532 126)、1.22倍(2 264 965/1 863 905)、0.85倍(406/477)和1.32倍(86/65)；HN-COⅠ产生的鱼类OTUs注释到种、属、科及科以上水平的占比分别为81.40%、11.63%和6.98%，MiFish-U则分别为81.54%、4.62%和13.85%。“引物+水样”的NMDS聚类图形成边界明显的2组(胁强系数=0.15)；HN-COⅠ的属内物种扩增子两两遗传距离最小值及平均值均分别是MiFish-U的1.23倍(0.006 9/0.005 6)和1.57倍(0.155 9/0.099 4)。室内6个密度组鲤鱼(Cyprinus carpio carpio)“生物量–拷贝数”线性回归方程的相关系数较低，HN-COⅠ及MiFish-U均无法准确反映鲤鱼的生物量。本研究筛选并比较了HN-COⅠ与MiFish-U的优劣，表明HN-COⅠ对海南岛淡水鱼类具有更高的靶向性，不仅在防止微生物、哺乳类等非目标生物eDNA污染方面有优势，而且更有利于海南岛淡水鱼类的检出和准确鉴定。     

鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证

为了筛选一个通用性和适用性良好的能够运用于环境DNA(eDNA)研究的鱼类引物,从相关文献中选取了鱼类线粒体基因组部分片段的5对引物,分别对线粒体D-loop区、16S rRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增。对千岛湖48种鱼类基因组DNA进行扩增后比较发现,引物16s和COI均可以取得良好的扩增效果,通用性优于其他几对引物。引物16s的扩增产物经凝胶电泳检测均出现明亮的目的条带,引物COI则有3种鱼的条带经凝胶电泳检测亮度较暗。利用上述引物对环境样品eDNA扩增时发现,只有16s和COI的引物具有良好的扩增效果,能够得到明显单一的亮带。对该两种引物的PCR产物克隆后测序比对发现,16s的PCR产物均为千岛湖常见鱼类物种的基因片段,COI的PCR产物则为细菌COI基因的部分片段。综上,我们认为引物16s在通用性和适用性上都更为适合作为鱼类群落结构eDNA研究的通用引物。     

泥蚶34个EST-SSR标记的开发及在格粗饰蚶中的通用性检测

利用泥蚶转录组高通量测序、拼接获得的大量EST序列开发SSR标记,在1123条EST序列里筛查到73条含有SSR位点的EST序列,其中54个位点适合设计引物,在位点两侧设计引物并进行PCR扩增.结果显示,46对引物获得稳定扩增的位点,引物在泥蚶奉化群体的多态性检测中发现,有34对引物表现出多态性,共扩增出122个等位基因,各位点的等位基因数Na为2～7个,平均每个位点产生3.59个等位基因,观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0.000 ～ 0.600、0.078 ～0.771、0.106～0.718;Hardy-Weinberg平衡检测显示,13个位点偏离了平衡状态;用Nr和Swiss-Prot蛋白质数据库对含有多态性SSR的EST进行了基因注释,25个SSR位点来自注释基因序列.将34对泥蚶多态性SSR引物在格粗饰蚶中进行了通用性检测,结果有1 1对成功扩增,8对表现为多态,通用率为23.53％,这些通用引物可用于两种蚶的遗传多样性评价、系统进化分析、比较作图和基因发掘等研究.     

环境DNA技术及在鱼类监测中的应用

开展鱼类监测对鱼类多样性保护具有非常重要的意义。环境DNA(eDNA)技术使得鱼类调查更加省时省力、节约成本、无损伤,在鱼类监测中被广泛使用。文章从环境DNA技术及其优缺点、技术流程及方法、国内外研究现状以及该技术的未来展望4个方面进行了综述。eDNA技术存在着一定的缺陷,不能完全取代传统方法。e DNA技术包含了样品的采集及处理、eDNA提取、eDNA扩增、测序和生物信息学分析几个主要步骤,每个步骤又可采取不同的实验方案,进而影响eDNA的检测效率。eDNA技术主要应用于鱼类物种多样性监测、入侵物种检测、濒危物种检测和鱼类生物量的估算等方面。虽然国内eDNA的起步不晚,但相比国外研究方向较为单一,研究深度不高,需要进一步重视。     

环境DNA技术在象山港水域鱼类多样性调查中的应用与评估

通过对象山港水域环境DNA(eDNA)样品的采集和高通量测序分析,并结合渔业资源调查数据,阐述象山港主要鱼类群落的种类组成和多样性特征,探讨了环境DNA技术在典型海域鱼类多样性研究中的应用前景.结果显示,共从象山港水域环境DNA样品中检测到26个常见鱼类物种,隶属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)的7个目中的2...     

基于转录组测序的圆口铜鱼SSR标记初步筛选及特征分析

分析圆口铜鱼(Coreius guichenoti)的遗传多样性,可为其人工繁殖家系鉴别、分子标记辅助育种及长江上游珍稀特有鱼类的种质资源保护提供理论依据和技术支撑。以室内循环水养殖的圆口铜鱼为研究对象,提取其肝脏RNA,通过Illumina HiSeq? 2000 高通量测序平台进行转录组测序,利用MISA软件对测序获得的unigene进行微卫星（SSR）位点挖掘和特征分析,设计SSR位点引物并进行验证。结果显示,圆口铜鱼转录组测序共获得80 688条 unigene,通过查找获得34 155个SSR位点,分布在25 947条序列上,发生率为32.2%。圆口铜鱼SSR中主要重复单元类型为单碱基和二碱基,其中A/T和AC/GT为优势单碱基和二碱基重复单元,占总SSR数量的57.2%和19.7%。SSR重复数在5~60次,其中有40.3%的SSR序列集中在11~15次;SSR序列长度变化显著,单碱基至六碱基重复类型的总体长度在11~101 bp,其中12~35 bp序列长度占78.8%。随机选取50个SSR位点合成引物对9尾圆口铜鱼样本进行PCR 扩增验证,可稳定扩增出目的条带的有40对引物,其中16对具有多态性,证明了通过转录组测序开发圆口铜鱼SSR标记的可行性。     

基于转录组测序的圆口铜鱼微卫星标记筛选

分析圆口铜鱼(Coreius guichenoti)的遗传多样性,可为其人工繁殖家系鉴别、分子标记辅助育种及长江上游珍稀特有鱼类的种质资源保护提供理论依据和技术支撑。以室内循环水养殖的圆口铜鱼为研究对象,提取其肝脏RNA,通过Illumina HiSeq~(TM) 2000高通量测序平台进行转录组测序,利用MISA软件对测序获得的unigene进行微卫星(SSR)位点挖掘和特征分析,设计SSR位点引物并进行验证。结果显示,圆口铜鱼转录组测序共获得80 688条unigene,通过查找获得34 155个SSR位点,分布在25 947条序列上,发生率为32.2%。圆口铜鱼SSR中主要重复单元类型为单碱基和二碱基,其中A/T和AC/GT为优势单碱基和二碱基重复单元,占总SSR数量的57.2%和19.7%。SSR重复数在5～60次,其中有40.3%的SSR序列集中在11～15次;SSR序列长度变化显著,单碱基至六碱基重复类型的总体长度在11～101 bp,其中12～35 bp序列长度占78.8%。随机选取50个SSR位点合成引物对9尾圆口铜鱼样本进行PCR扩增验证,可稳定扩增出目的条带的有40对引物,其中16对具有多态性,证明了通过转录组测序开发圆口铜鱼SSR标记的可行性。     

利用环境DNA技术探测南海西沙鲸类物种多样性

本研究通过提取南海西沙海域水体样本的环境DNA,利用鲸类线粒体12S r RNA和16S r RNA通用引物进行扩增和高通量测序,并结合目视观测的结果探讨环境DNA技术在鲸类物种多样性研究中的应用前景。结果显示,4种通用引物在鲸类鉴定方面具有一定的有效性,利用4种通用引物在西沙海域19个站点的样品中检测到5种鲸类,分别为热带斑海豚(Stenella attenuata)、长吻飞旋海豚(Stenella longirostris)、弗氏海豚(Lagenodelphis hosei)、小布氏鲸(Balaenoptera edeni edeni)和短鳍领航鲸(Globicephala macrorhynchus),采样过程中观测到的3种鲸类分别为:热带斑海豚、长吻飞旋海豚和瑞氏海豚(Grampus griseus)。两种方法检获的优势物种一致,利用环境DNA技术检测到了未被观测到的物种。结合引物Cet-12S和Marver3的检测结果可以涵盖所有站点(n=17)和所有鲸类物种(n=5),表明针对不同基因片段的引物结合使用有利于检测效果的提高。对于检出的鲸类序列和物种数,4种引物之间不存在显著...     

长江中下游干流环境DNA样本鱼类物种检测的初步研究

为开发适用于长江鱼类的环境DNA检测体系,在长江中下游干流24个采样点同步采集水样,抽滤后提取环境DNA,利用线粒体细胞色素B简并引物进行PCR扩增,扩增产物克隆测序得到419条序列,通过在Gen Bank核酸序列数据库进行BLAST序列比对确定物种信息,从来源于17个采样点的115条匹配成功的序列中,共检测到10种鱼类序列,代表15种鱼类。     

基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估

为建立岩原鲤基于环境DNA （eDNA）的实时荧光定量PCR （qPCR）检测方法,准确鉴别岩原鲤并探讨e DNA浓度与其生物量的定量关系,实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针,利用PCR扩增出岩原鲤12S rRNA基因的序列,克隆入pMD19-T载体,构建重组质粒作为qPCR标准;使用梯度稀释质粒标准品作为模板,进行qPCR扩增,制作标准曲线,建立岩原鲤qPCR检测方法,并评价其特异性、灵敏性和应用效果。结果显示,引物和TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,显示阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号,表现为阴性;qPCR的阈值循环数（C_t）与标准品拷贝数的线性关系好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数（R²）达到0.999,检测限位DNA浓度为5×10^-6 ng/μL,扩增效率为94.7%;检测养殖不同数量岩原鲤的水体中eDNA浓度,目标DNA浓度和岩原鲤数量存在线性正相关性（R²=0.957）,得到岩原鲤DNA浓度与其个体数...     

大型河流中鱼类组成的eDNA监测效率:以长江武汉江段为例

为了探讨大型河流中的eDNA监测效率,以长江为大型河流的代表,以鱼类为水生生物的代表,分析传统捕捞监测和eDNA监测结果的差异,研究eDNA监测技术对长江武汉江段鱼类组成的监测能力、监测效率、平行样设置等问题.结果显示:(1)用1对eDNA宏条形码引物(mlCOIintF/jgHC02198R)共监测到89种鱼类,其中...     

长江上游干流三层流刺网渔获物结构研究

利用2010—2012年长江上游宜宾和江津江段三层流刺网渔获物的调查数据,分析了三层流刺网的主要捕捞对象和个体大小,阐述长江上游干流渔获物结构现状。结果显示,鱼类样本共计673.32 kg,分属4目9科47种;其中,鲤科鱼类占比最大,为61.70%,其次是鲿科,为10.64%,长江上游特有鱼类11种,占鱼类总种数的23.40%。主要捕捞渔获对象多为未达到性成熟的个体。对宜宾和江津两江段三层流刺网渔获物种类、物种相似度和生物多样性指数进行了比较分析,宜宾江段鱼类39种(含特有鱼类8种),分属4目8科,江津江段鱼类40种(含特有鱼类11种),分属4目9科;江津江段渔获种类和特有鱼类数量均高于宜宾江段,宜宾和江津两个江段三层流刺网的鱼类物种相似度为81.01%;宜宾江段物种多样性指数为2.81,略高于江津江段的2.76,但两江段的多样性指数无显著差异。通过本次研究可以为分析向家坝等水电站蓄水对长江上游鱼类的影响提供数据参考,同时也为长江上游鱼类资源的保护和渔业规划提供依据。     

长江上游中华金沙鳅和短身金沙鳅线粒体遗传多样性研究

为了解中华金沙鳅(Jinshaia sinensis)及短身金沙鳅(J.abbreviate)遗传多样性,本研究采用线粒体DNA控制区序列,对长江上游巴南、江津、合江、宜宾、犍为、巧家、宁南和攀枝花等8个群体的中华金沙鳅(Jinshaia sinensis)及巴南、合江和犍为3个群体的短身金沙鳅(J.abbreviate)的遗传多样性进行研究。结果显示:中华金沙鳅和短身金沙鳅的遗传结构存在差异,中华金沙鳅的遗传多样性较高,单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.999和0.0182;而短身金沙鳅的遗传多样性水平较低(Hd:0.411,Pi:0.0005)。分子变异方差分析(AMOVA)显示两种鱼均无显著地理遗传分化,但单倍型系统发育树和网络结构图揭示了中华金沙鳅存在群体内遗传分化,形成三个谱系,表明缺乏长期亚群体隔离和高水平基因流。中性检验和Bayesian skyline plot(BSP)结果表明,中华金沙鳅在历史上曾发生过群体扩张事件,扩张时间约在10万~17万年前。     

大渡河上游鱼类资源现状

2017-2019年,对大渡河上游鱼类种类组成、优势种和多样性指数等进行了调查.结果显示:大渡河上游采集到鱼类2目6科24种,其中包括了四川省级保护鱼类2种、长江上游特有鱼类8种以及外来物种3种.大渡河上游现有分布鱼类以齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)和重口裂腹鱼(S.davidi)等为优势种群...     

人工模拟条件下环境DNA宏条形码技术的定量分析初探

近年来,环境DNA宏条形码技术(eDNA metabarcoding)在水生生态系统生物多样性评估等相关领域中得到广泛应用,因其具有快速测算群落中物种丰度的潜能,eDNA宏条形码技术成为资源保护和管理中颇具应用前景的调查工具.虽然大量证据表明eDNA高通量测序获得的reads数与自然环境中生物相对数量具有相关性,但一直...     

长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区干流段鱼类群落结构特征分析

长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区位于向家坝坝下江段，随着金沙江下游梯级水电站相继蓄水运行和“十年禁渔”政策的实施，保护区干流段鱼类群落可能会发生改变。为探究“十年禁渔”前保护区干流段鱼类群落结构特征，基于该江段2017—2019年渔获物监测数据，对鱼类种类组成、生态类型、群落相似度、物种优势度、生物多样性以及群落结构稳定性等特征进行分析。结果显示，本次调查共采集到鱼类134种，隶属于7目21科83属，其中长江上游特有鱼类有27种，外来物种有12种，分别占总种类数20.15%和8.96%。鱼类群落以底层、产沉性卵、杂食性鱼类为主。等级聚类分析(Cluster)和非度量多维尺度分析(NMDS)显示，在一定的相似性水平上，保护区干流段鱼类的群落类型基本可分为3组，宜宾、泸州与合江可以聚为一组，巴南、江津分别独立成组。保护区干流优势种共有14种，其中瓦氏黄颡鱼是整个研究区域的优势种，在合江站点的优势度最高，IRI值为27.00%。Shannon-Wiener指数、Simpson指数、Margalef指数和Pielou指数变化范围分别为2.725～3.306、0.883～0.942、5.83...     

基于环境DNA metabarcoding的西轩岛近海鱼类多样性研究

鱼类多样性的保护对于生态系统的科学管理和资源的可持续利用至关重要。环境DNA metabarcoding技术的出现和应用为水生生物的调查与监测带来了强有力的技术革新。本研究以浙江舟山近海岛屿——西轩岛为例,设计了4个不同采样站位,先后于2019年2月(冬季)、5月(春季)和11月(秋季)共采集水样12个,通过环境DNA提取、扩增、高通量测序以及生物信息学分析,对西轩岛近海鱼类多样性进行了分析,同时评估了鱼类多样性的时空差异。结果显示,共监测到鱼类33种,隶属于12目26科32属,其中,鲈形目(Perciformes)种类最多,共19种,约占所有种类的57.6%。不同采样季节的多样性指数和均匀度指数均存在显著差异,表明季节可能是影响西轩岛近海鱼类多样性的因素之一。综合时间和空间分析的结果显示,在繁殖季节且远离舟山本岛一侧的采样点监测到的鱼种数量更多。通过比对之前传统渔业资源调查的结果发现,不同季节优势种存在较大变化,可能与采样点数量较少且集中有关。进化树富集结果显示,各季节的优势鱼种与传统调查手段的结果有较大差异,表明目前环境DNA仍不能完全替代传统调查方法,但可以将环境DNA方法与传统的调查方法相结合,以确保监测结果的准确性和可靠性。     

长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区干流段鱼类组成及其多样性

2010年9-11月、2011年5-7月和9-11月、2012年5-7月在长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区干流宜宾、合江及江津江段进行了4次鱼类资源调查,共采集鱼类样本27 836尾,隶属于7目17科111种(亚种),其中长江上游特有鱼类27种,产漂流性卵鱼类45种,外来鱼类6种。宜宾、合江及江津江段鱼类物种数分别为85、91及91种,宜宾与合江江段鱼类相似度指数为69.23%,合江与江津江段为71.70%,宜宾与江津江段为77.78%。铜鱼(Coreius heterodon)、南方鲇(Silurus meridionalis)、长鳍吻(Rhinogobio ventralis)及圆口铜鱼(C.guichenoti)为保护区干流主要经济鱼类,产漂流性卵鱼类占渔获物总重量的66.35%。鱼类Shannon-Wiener多样性指数在4次调查中江津江段均最高,宜宾次之,合江最低,但三江段之间多样性指数均无显著性差异(P>0.05)。与历史资料相比,该江段鱼类资源明显减少,急需加强保护措施。     

长江胭脂鱼人工放流子一代遗传多样性初步研究

运用微卫星分子标记对80尾胭脂鱼人工放流子一代个体的遗传多样性和种群遗传结构进行了分析。用磁珠富集法构建了胭脂鱼(AAAG)n富集文库,从中分离并鉴定得到的22个微卫星位点最终设计合成18对引物。对长江中、上游的80尾人工增殖放流的胭脂鱼子一代进行了遗传多样性的初步研究,其中5对引物呈现多态性,等位基因数目为 2～8个;多态信息含量0.2957～0.8038;Shannon多样性指数0.5466～1.8840;观测杂合度0.3056～0.7222;期望杂合度0.3658～0.8381;Hard-Weinberg遗传偏离指数（D）-0.1818～0.4287。结果初步表明,胭脂鱼人工放流子一代处于较高的遗传多样性水平,但很大程度上仍受到人类活动的影响。