两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

大青杨纤维素合酶PuCesA 7基因片段的克隆及序列分析

本研究以大青杨叶片总DNA为模板,用已登录的欧洲颤杨PtrCesA7保守序列设计引物,进行TD-PCR扩增并将得到的片段克隆到pMD18-T载体中。测序结果分析表明,片段长2341bp将该基因片段命名为PuCesA7。经BLASTX比对,此片段包含6个编码区,共1248bp,编码416个氨基酸。并与欧洲颤杨的PtrCesA7基因的同源性为98%,证明克隆的片段为纤维素合酶基因。将该片段与GenBank中登录的玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、欧洲颤杨(Populus tremuloides)、新西兰辐射松(Pinups radiata D.Don)同源纤维素合酶基因序列比对并进行进化树分析。结果表明,大青杨纤维素合酶基因片段均与它们的亲缘关系较远。     

棉花纤维素合酶复合体蛋白的分离与鉴定

选用开花后24 d的棉纤维提取原生质膜,用Triton X-100溶解后通过纤维素合酶1(Gossypium hirsutum cellulose synthase1,GhCESAl)抗体进行免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),以聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离免疫共沉淀的产物,用液相色谱-质谱联用仪(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)进行鉴定.结果表明,棉纤维纤维素合酶复合体可能存在68种蛋白,其中包括8种纤维素合酶(Cellolose synthse,CESA),它们涵盖了棉纤维初生壁和次生壁2种类型纤维素合酶.这说明在次生壁形成的细胞中存在2种类型CESA.本研究也表明复合体中存在非CESA蛋白.     

甘蓝型油菜蔗糖磷酸合酶(SPS)基因家族成员鉴定及表达分析

蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase, SPS)是调控植物蔗糖合成的限速酶, 对光合产物的转运和积累有重要影响。利用拟南芥SPS蛋白保守结构域在甘蓝型油菜基因组数据库鉴定出11个甘蓝型油菜SPS基因家族成员, 根据系统进化分析将其分成A、B和C共3个亚家族。基因结构预测表明, SPSC-1有5个外显子, 其他SPS基因均有11~15个外显子。顺式作用元件分析表明, 油菜SPS基因除含基本的启动子保守元件外, 还含有许多与逆境和激素响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明, BnSPSA1在花中表达量最高, BnSPSA2在各组织中均有不同程度的表达, BnSPSB只在叶、蕾和花中表达, BnSPSC在叶中表达量最高, 在蕾和花中有少量表达而在其他组织中基本不表达, 说明SPS基因在甘蓝型油菜中的表达具有明显的组织特异性; BnSPSA1和BnSPSC在高生物产量油菜叶片中的表达高于低生物产量油菜, BnSPSB则在低生物产量油菜中的表达量更高, 说明SPS基因与油菜生物产量密切相关。本研究为油菜SPS基因的功能研究和利用奠定了基础。     

越南油茶环阿屯醇合酶基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆的方法克隆得到环阿屯醇合酶基因全长并命名为CvCAS,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvCAS全长2 411 bp,包括一个2 277 bp完整的开放阅读框,编码758个氨基酸,与茶(Camellia sinensis)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis var. chinensis),刺楸(Kalopanax septemlobus)和人参(Panax ginseng)的CAS蛋白序列相似度均在85%以上,系统发育树分析显示CvCAS与茶(Camellia sinensis)和向日葵(Helianthus annuus)的CAS蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为86.6 kD,理论等电点为6.20,无跨膜螺旋区,属于不稳定亲水性蛋白。序列比对分析表明,CvCAS具有氧化鲨烯环化酶(OSCs)超家族典型结构位点(DCTAE),三萜合成酶高度保守结构...     

漆树查尔酮合酶基因家族生物信息学分析

查尔酮合酶(CHS)是黄酮类化合物合成过程中的关键酶。为了进一步探索CHS基因家族在调控黄酮类物质合成中的功能,本研究对12个漆树CHS基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、蛋白二级结构以及系统进化等方面进行初步生物信息学分析。保守结构域分析发现12个TvCHS基因均含有CHS-Like保守序列;12个TvCHS基因除了TvCHS10在叶中不表达和TvCHS11在根中不表达,其余10个基因在漆树根茎叶都有表达;12个CHS蛋白中有4个疏水蛋白、8个亲水蛋白。在系统进化分析中,漆树CHS基因家族12个基因被划分为两个组。信号肽预测分析发现12个TvCHS基因均为非分泌蛋白;磷酸化位点预测分析发现丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点数量最多,络氨酸最少。本研究对漆树CHS基因家族进行鉴定和分析,为进一步研究漆树CHS基因家族的功能提供了一定的参考和依据。     

白木香倍半萜合酶基因AsVS的克隆与表达分析

法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)是植物萜类化合物合成途径的重要前体之一,经不同的酶催化可形成各类萜类化合物,Vetispiradiene合酶可催化FPP形成Solavetivone和Lubimin的前体Vetispiradiene。本研究利用白木香转录组数据,首次克隆了编码白木香Vetispiradiene合酶的基因(命名为As VS, Genbank登录号为MH378283),AsVS基因序列全长为1 632 bp,编码543个氨基酸,该氨基酸序列与马来沉香倍半萜合酶聚类于同一分支,具有较近的亲缘关系,该蛋白植物倍半萜的保守性结构域DDXXD,NST/DTE和R(R)X8W,相对分子量为62.73 kD,理论等电点为5.51,包含40个磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;不含跨膜结构域。RT-qPCR分析结果表明AsVS基因在结香剂处理过程中于白木香茎干样品中持续上调表达,其第6天及第9天的表达量分别为对照处理的2.36和5.02倍。此结果为进一步研究As VS基因在白木香萜类化合物的合成及沉香致香成分富集中的功能提供了理论基础。     

外源纤维素合酶基因对棉纤维品质的改良作用

 为改良棉花纤维品质,将由35S启动子驱动的木醋杆菌纤维素合酶基因acsA和acsB,用子房注射法和花粉粒媒介法转化棕色棉G007和白色棉X003,并检测后代棉纤维品质。研究结果表明,子房注射法的基因转化效率高于花粉粒媒介法。通过PCR和southern blot检测,最终获得转基因植株共11株。根据农艺性状表现,选出4个优良单株。对转基因当代及后代的检测结果表明,棕色棉纤维长度、比强度、纤维素含量和衣分都显著增加,而白色棉只有纤维比强度和纤维素含量显著增加。纤维长度和衣分没有变化。导入由35S启动子驱动的木醋杆菌纤维素合酶基因acsA和acsB,提高了转基因后代的棉纤维品质。     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

棉花纤维素合酶基因GhcelA1克隆及其载体构建

 根据GeneBank 中GhcelA1（U58283）序列,利用RT-PCR技术,从棉纤维中克隆到GhcelA1 cDNA全长。运用基因重组技术,构建pCAM2300-35S-GhcelA1过表达载体;融合基因表达载体pCAM2300-35S-GhcelA1-EGFP,以及pCAM2300-35S-GhcelA1-RNAi载体,这些载体均通过限制性酶切鉴定和测序验证。农杆菌介导法将融合基因转化棉花子叶,通过激光共聚焦荧光显微镜,在蓝色激发光下观察诱导的愈伤,发现在转化的活体细胞核与质膜内侧有绿色荧光,说明融合基因载体EGFP构建正确,可以在棉花中正常表达。所构建的系列载体可用于转化棉花,促进纤维素在棉纤维中合成与积累。     

雷蒙德氏棉KNOX基因家族全基因组鉴定及表达分析

为探究KNOX基因家族在棉花生长发育中的调控作用,本研究以雷蒙德氏棉为材料,利用生物信息学的方法全基因组鉴定KNOX家族成员,并对其保守结构域、进化模式、染色体定位、基因结构和基因表达情况进行分析。共鉴定到22个KNOX基因,分布于10条染色体上,其中13个基因发生了片段复制。除GrKNOX9和GrKNOX15外,其余GrKNOX蛋白均含有KNOX1,KNOX2,ELK和HOX四个典型结构域。Gr KNOX基因家族进化聚类成两组：ClassⅠ和ClassⅡ。ClassⅠ组包含13个基因,ClassⅡ组含有9个基因。GrKNOX基因在叶片、花瓣、开花后10、20、30和40 d的种子中的表达分析显示,ClassⅠ组成员表达模式差别较大,ClassⅡ组成员表达模式较相似。GrKNOX12、GrKNOX1、GrKNOX17、GrKNOX2、GrKNOX11、GrKNOX3和GrKNOX22在测定的组织中表达量均较高;GrKNOX6、GrKNOX16和GrKNOX19在开花后20、30和40 d的种子中表达量较高,推测这3个基因参与调控棉花种子发育过程。本研究为进一步探究KNOX基因家族在棉花...     

北柴胡环阿屯醇合酶基因的全长克隆与表达分析

环阿屯醇合酶(CAS)是柴胡中植物甾醇类物质合成途径的关键酶,与柴胡皂苷合成途径的关键酶基因β-香树酯醇合酶(β-AS)竞争共同的前体物质,影响柴胡皂苷的积累.为探究柴胡中环阿屯醇合酶的作用,本研究以北柴胡cDNA为模板,克隆获得北柴胡环阿屯醇合酶基因BcCAS的全长序列,对BcCAS全长cDNA序列及其编码氨基酸序列...     

荔枝漆酶(LAC)基因家族鉴定及表达分析

探索荔枝漆酶(LAC)基因家族的数量、结构和进化关系,可以为解析漆酶基因功能提供理论依据,为探索荔枝果皮褐变机制提供基础。本研究利用生物信息学分析手段,对LAC基因家族成员数量、保守结构域、家族成员的亚细胞定位及染色体位置、系统发育和顺式作用元件,以及基因家族成员在不同组织器官和采后贮藏果皮中的表达情况进行了分析。结果表明,荔枝基因组中共鉴定出61个LAC家族成员,编码的氨基酸残基长度在127～958 aa,分子量在14.07～103.47 Da,等电点在4.42～10.34;亚细胞定位分析表明,有19个LAC家族成员定位在叶绿体中,17个LAC家族成员定位在液泡中,其他成员分别定位在内质网、细胞外基质等。61个荔枝LAC家族成员分别定位在10条染色体上,其中第13号和8号染色体上LAC基因数量最多,且呈簇状分布于染色体一端。系统发育树将荔枝LAC家族分为5个亚组,第Ⅴ亚组最大,有30个家族成员,第Ⅳ亚组最小,仅有8个家族成员。荔枝LAC家族的结构域组织相对保守,具有典型的Cu-oxide漆酶结构域。荔枝LAC基因启动子序列分析发现了大量的顺式作用元件,可能与漆酶家族功能多样性相关。1...     

白木香聚酮合酶基因AsPKS02的克隆及表达分析

沉香是一种名贵中药和天然香料.2-(2-苯乙基)色酮是其主要的特征性成分,聚酮合酶(PKS)是2-(2-苯乙基)色酮类化合物生物合成的关键酶之一.本研究根据转录组数据在白木香中克隆了一个新的聚酮合酶基因,命名为AsPKS02.该基因包含一个1185 bp的完整开放阅读框,编码395个氨基酸.AsPKS02具有典型的聚酮...     

樟叶越桔过氧化氢酶VdCAT1基因的克隆与生物信息学分析

作为植物抗氧化防御系统的主要保护酶之一,过氧化氢酶在植物细胞响应逆境胁迫应答方面发挥重要作用.本研究通过生物信息学分析RNA-Seq数据(NCBI登录号:PRJNA285946),结合RT-PCR技术首次从樟叶越桔成熟叶片中获得了过氧化氢酶基因VdCAT1全长为1 611bp的cDNA序列,完整开放阅读框(ORF)长度...     

甘蓝乙二醛酶基因家族的鉴定与表达分析

乙二醛酶(glyoxalase, GLY)是植物应对醛酮类有害物质胁迫的重要酶,对于植物应对非生物胁迫有重要意义。本研究从甘蓝数据库中鉴定获得了15个BolGLYI和16个BolGLYII,利用生物信息学方法系统分析了这些GLY基因的染色体定位、基因结构、蛋白的等电点、分子量、进化关系、保守基序,以及组织表达模式。结果表明,BolGLYI在染色体分布很集中,而BolGLYII的分布比较分散;甘蓝两类GLY基因家族都分成5个亚群,且其与拟南芥的亲缘关系比和水稻更近;同源关系越近的BolGLY基因,其基因结构和保守基序都更相似;BolGLYI家族的基因成员组织表达差异较大,在逆境条件下BolGLYI07和BolGLYI13基因表达量显著高于BolGLYI家族的其他基因,而BolGLYII的各个家族成员在各组织的表达差异不明显,在磷和锌元素胁迫条件下BolGLYII01基因和BolGLYII09基因表达显著高于其他基因,以上结果为进一步研究BolGLY基因的功能提供了理论基础。     

梨PbrCCD基因家族鉴定与表达分析

为了对梨PbrCCD基因家族的功能进行深入研究,本研究利用生物信息学方法对梨PbrCCD基因家族进行鉴定,并对其家族成员的理化性质,基因结构,保守基序,表达模式等进行分析。结果表明：在梨中共鉴定到22个PbrCCD基因家族成员,均包含CCD基因的RPE65保守结构域,编码氨基酸在183～617,分子量大小在20.49～69.10 kD,不稳定系数为25.54～46.58,等电点为5.00～8.01,脂肪族氨基酸指数为67.16～87.31,亲水性为-0.445～-0.193,表明PbrCCD基因家族成员均为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果表明PbrCCD家族成员均定位在细胞质和线粒体上。二级结构分析表明,β-折叠的比例最低、无规则的比例最高。系统进化树分析将PbrCCD基因家族分成6组亚家族(CCD1, CCD4, CCD7, CCD8, CCD-like和NCED)。同一亚家族的成员基因结构较为相似,并预测了motif 7和motif 10两个保守基序元件。通过对砀山酥梨果实不同发育期的表达分析发现PbrCCD1a和PbrNCED5与果实的生长发育存在重要的关系。本研究初步分析梨Pbr...     

陆地棉漆酶基因家族成员表达模式分析

漆酶是铜蓝氧化酶蛋白家族的一员,在植物木质素合成和提高植株抵御胁迫能力等方面发挥着重要作用。本研究从陆地棉基因组中鉴定到104个漆酶基因(GhLAC)家族成员,进行了系统进化树和组织表达图谱的构建,并随机选取了20个基因进行荧光定量PCR分析,验证了表达热图的结果。为进一步探索漆酶在棉花中担当的角色,本研究采用启动子-GUS融合载体转化拟南芥,通过转基因拟南芥不同发育过程不同组织GUS染色结果,分析了陆地棉漆酶基因家族6个成员(GhLAC12A、GhLAC14A、GhLAC20A、GhLAC25D、GhLAC59D、GhLAC63D)的精细表达模式。为探究漆酶在逆境中发挥的作用,对该6个漆酶基因进行了切割和刺洞2种创伤胁迫诱导表达分析,并利用2个棉花品系‘84021’(高温耐受型)和‘H05’(高温敏感型)在常温和高温胁迫条件下不同时期的花药进行相应基因的荧光定量PCR分析。研究结果表明,随机挑选的20个基因在根、茎、叶、花瓣、花药和柱头6个组织中差异表达,大多数基因的表达与转录组结果一致。6个漆酶基因的启动子能够不同程度地驱动GUS基因在种子萌发时期、二叶期、四叶期表达;创伤处理结果...     

高粱淀粉合成酶基因家族鉴定与表达分析

对高粱淀粉合成酶基因家族的理化性质、系统进化树、基因结构、蛋白结构和顺式作用元件进行研究,通过转录组数据对该家族基因进行表达模式分析,运用生物信息学的方法在高粱全基因组中鉴定出11个淀粉合成酶基因,包括颗粒结合型淀粉合成酶和可溶性淀粉合成酶两类。结果表明,SbGBSSⅠ在胚乳中高表达;SbSSⅠ、SbGBSSⅡ和SbSSⅢb在开花14 d的根、茎、叶和幼苗中高表达,其中在叶片中的表达量最高;SbSSⅠ、SbGBSSⅡ、SbSSⅢb在花序展开的三个时期中高表达。