牛传染性鼻气管炎及病毒性腹泻流行病学调查及防控建议

为了解牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻在昆明地区的感染情况和流行趋势,该研究于2021—2022年采用实时荧光PCR方法对昆明市16个乡镇61家肉牛规模殖场的1394份棉拭子样品进行牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻病毒核酸检测。结果显示,2021年,牛传染性鼻气管炎病毒核酸个体阳性率0.23%、场群阳性率为2.78%,牛病毒性腹泻病毒核酸个体阳性率0.35%、场群阳性率为2.78%;经及时指导养殖场淘汰阳性病牛,2022年牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻病毒核酸全部为阴性。可见,及时发现并积极防控对根除牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻具有重要意义。     

河南省牛支原体的分离鉴定及其生物学特性研究

为了解河南省牛支原体的感染和流行情况,于2016年1—12月从河南省各地发生肺炎、乳房炎、子宫内膜炎的牛场采集肺、鼻拭子、牛奶、子宫积液等病料共计257份,分离鉴定牛支原体,并对其中1株分离自济源市某大型奶牛场的牛支原体HNMB1株进行生物学特性研究。结果显示,分离鉴定出87株牛支原体,分离率高达33.85%。HNMB1株在培养基中高效增殖,菌液浓度可达3.2×109cfu/m L;攻毒死亡率为75%,对犊牛具有较强的致病力;该菌株制备的疫苗对牛支原体的攻毒保护率为100%。可见,HNMB1菌株具有较好的免疫原性,可以作为牛支原体的疫苗候选毒株。     

利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪场中感染猪肺炎支原体研究(英文)

[目的]2012年3月至12月从江苏泰州某猪场采集303份鼻拭子样品,利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪肺炎支原体的感染情况。[方法]采集7、14、21、28、30和35日龄的猪的鼻拭子,4℃浸泡于PBS过夜,TIANamp?细菌DNA提取试剂盒提取DNA。然后进行Mhp183的荧光定量PCR及P36的巢式PCR检测。[结果]通过巢式PCR检测,12.5%(38/303)份样品为猪肺炎支原体阳性,用荧光定量PCR检测,50.2%(152/303)的样品为阳性。两种方法检测均为阳性的样品为22份,占7.3%,两种方法检测均为阴性的样品为127份,占41.9%。两种检测方法的感染模式相同,均在7日龄和35日龄的小猪中感染率最高,巢式PCR的感染率分别为15.6%和18.4%,荧光定量PCR的感染率分别为53.1%和56.6%。[结论]两种PCR方法均适用于猪场感染状态的检测。     

牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌三重PCR快速检测方法的建立

为建立快速、准确的检测牛呼吸道主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)及牛结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的方法,对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列分别设计特异性引物,对单一PCR检测方法进行优化后建立三重PCR检测方法。结果表明:三重PCR的最佳扩增条件为94℃预变性10min;94℃1min,60℃50s,72℃1min,循环30次;72℃延伸10min。建立的三重PCR方法能对同一样本中的3种病原菌进行扩增,特异性强。牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌的最低检测DNA浓度分别为5.306×10~(-3)ng/μL、3.075×10~(-2)ng/μL和1.605×10~(-4)ng/μL。建立的三重PCR方法临床检测牛支原体肺炎鼻拭子、牛结核分枝杆菌、结核菌素与单一PCR检测方法的阳性符合率为100%。三重PCR检测方法可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的单一和混合感染鉴别诊断,具有快速、准确、简便的特点。     

贵州省水城某肉牛场支原体肺炎诊治

为了解贵州省水城某肉牛支原体肺炎流行情况,试验结合流行病学调查、临床症状及病原菌分离及鉴定对该肉牛场支原体病进行初步诊断。结果表明,从感病肺样中分离得到的病原微生物具有支原体的典型特征。说明该肉牛场发生的流行病为牛支原体感染引起的牛传染性肺炎。     

西藏那曲牦牛BRDC细菌病原核酸检测与分析

为掌握西藏那曲地区牦牛呼吸道疾病综合征5种细菌病原的感染情况,对2018年-2019年采集的572份牦牛鼻拭子运用qPCR技术检测牛支原体（Mb）、多杀性巴氏杆菌(Pm)、溶血曼氏杆菌（Mh）、睡眠嗜组织菌(Hs)、化脓隐秘杆菌（Tp）5种病原。结果显示,Mb、Pm、Mh、Hs和Tp检出率分别为18.18%  （104/572）、11.89%（68/572）、6.99%（40/572）、7.17%（41/572）和5.77%（33/572）。2019年6月Mb、Pm和Tp样品阳性率显著高于2018年11月样品;不同性别中5种病原阳性率差异不显著;不同年龄段中Mh组间阳性率差异显著;不同饲养模式下Mb、 Pm、Mh和Tp组间阳性率差异显著。混合感染可以存在这5种病原之间,二重感染阳性率较高的为牛支原体/多杀性巴氏杆菌4.55%(26/572),三重感染阳性率较高的为牛支原体/多杀性巴氏杆菌/溶血曼氏杆菌1.57%（9/572）,四重感染最高的为牛支原体/多杀性巴氏杆菌/溶血曼氏杆菌/睡眠嗜组织菌0.52%（3/572）,且存在同时在一例样品中检出5种病原。结果表明,西藏那曲地区牛呼吸道疾病综合征细菌病原牛支原体和多杀性巴氏杆菌占优,且存在两种以上病原混合感染。     

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用

为建立检测兔群鼻拭子中兔出血症病毒(RHDV)的RT-PCR方法,研究健康免疫兔群是否存在携带RHDV现象,根据GenBank上公布的RHDV vp60基因保守序列,设计了1对特异性引物,经cDNA合成和PCR扩增,目的片段大小为586 bp.结果表明该方法能检出最小RNA浓度为2.4 ng/L,敏感性为血凝试验8 000倍.通过对来自泰州市5个地区采集的100份健康免疫兔鼻拭子样品进行检测,结果显示,阳性样品为11份,阳性率为11％.表明RT-PCR方法能快速、敏感地从健康免疫兔鼻拭子样品中检出RHDV,提示健康免疫兔群存在携带RHDV的现象.     

肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断

采用多种诊断方法,对2008年以来湖北省多个地区新引进育肥肉牛呼吸道传染病进行了病原学研究.患牛病理变化主要集中在肺部,轻者可见肺局部肉样变,严重者可见肺广泛分布干酪样或化脓性坏死灶.将肺坏死组织制作石蜡切片,显微镜观察发现,肺组织表现为坏死性肺炎,未见典型的结核结节.实验室病原检测项目包括:支原体培养鉴定,PCR检测与目的基因测序鉴定;细菌分离鉴定;牛结核检测;泰勒虫血涂片检测与PCR检测等.最终确定该新发呼吸道传染病为牛支原体(Mycoplasma bovis)肺炎.同时,环形泰勒虫混合感染与细菌继发感染率很高,使病情复杂化.通过药敏试验发现,不同牛场分离的牛支原体最敏感药物为环丙沙星,其次为左氟沙星、四环素.文中还对该病的综合防治提供了合理的建议.     

猪鼻腔棉拭子中胸膜肺炎放线杆菌检测与分离方法的优化

为提高APP亚临床感染的核酸检出率和细菌分离率,通过检测3种PCR的敏感性和特异性,运用3种PCR方法分别检测母猪鼻腔棉拭子中APP核酸;并同时使用4种选择性培养基分离母猪鼻腔棉拭子中APP。结果显示,3种PCR的最低检测限度均为102 CFU,且除APP外与其他细菌不发生反应;dsb E-PCR方法的App核酸检出率(23.7%)显著高于oml A-PCR(8.1%)和Apx IVA-PCR(14.8%),三者符合率较高,分别为84.4%(dsb E/oml A-PCR)、91.1%(dsb E/Apx IVA-PCR)和93.3%(oml A/Apx IVA-PCR);m PPLO的APP分离率(11.9%)显著高于TSA(0.7%)、CA(5.2%)和BA(2.2%),四者符合率较高,分别为88.9%(m PPLO/TSA)、93.3%(m PPLO/CA)、90.37%(m PPLO/BA)、95.6%(TSA/CA)、98.5%(TSA/BA)和97.0%(CA/BA);dsb E-PCR检测结果与m PPLO分离结果的符合率较高(88.1%)。说明dsb E-PCR和m PPLO的检测分离效率最高,可综合2种方法,完善APP检测分离操作程序,为APP亚临床感染的诊断和治疗以及疫苗免疫提供科学依据。     

牛支原体疫苗候选株的筛选及免疫原性研究

为筛选牛支原体疫苗候选菌株并评价其对新西兰大白兔的免疫原性,本试验从病牛鼻拭子和乳样中分离牛支原体,通过形态学鉴定、活菌滴度鉴定验证和PCR方法进行鉴定;分离鉴定后的牛支原体免疫新西兰大白兔后,进行免疫原性试验。结果表明:筛选得到10株奶牛支原体,选取5株并验证其符合牛支原体的典型特征,其中,BV-01株对其它4株的ELISA效价均高于1:10 667。BV-01株牛支原体有较好的免疫原性,初步证明其可作为牛支原体疫苗候选株。     

广西奶水牛结核病三种检测方法的比较

应用牛结核变态反应、PCR和分离培养3种方法,对奶水牛进行牛结核病检测,比较3种检测方法的符合率。结果表明,1850头奶水牛中有78头奶水牛的皮内变态反应结果为阳性,而对变态反应阳性的牛样品进行PCR检测和分离鉴定,分别鉴定出4份和2份牛分枝杆菌。阳性检出率以变态反应为最高(4.22%),PCR和分离鉴定的较低,分别为0.21%和0.11%。变态反应与PCR检测、分离鉴定的符合率较差,而PCR检测与分离鉴定的符合率相对较接近。因此建议,在对奶水牛群进行结核病检测时,应先以变态反应检疫牛群,再结合PCR检测进行综合诊断,更有利于奶水牛结核病的检测与净化。     

牛精液中IBRV荧光PCR检测方法的建立及精液带毒与血清抗体的关系

【目的】建立牛精液中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光PCR检测方法,并分析精液带毒与血清抗体的关系,为牛精液中IBRV的荧光PCR诊断和判定提供技术依据。【方法】采用Sephycral S-400凝胶过滤法和蛋白酶K预消化法,分别对新鲜牛精液和冻存牛精液进行处理,用DNA Zol方法提取病毒核酸,通过PCR反应条件的优化,建立了牛精液中直接检测IBRV的荧光PCR方法,对该方法进行特异性和重复性检验;最后用该方法分别对120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行检测,同时用普通PCR方法和病毒分离方法加以对比;并对其中的10头牛定期采集精液、鼻腔拭子和血清样品,用该荧光PCR方法进行病原检测,对血清样品进行IBRV抗体检测。【结果】建立的荧光PCR方法具有较好的特异性,重复性和稳定性很好。用该方法可检测到新鲜牛精液中0.002 TCID50的病毒粒子,检测到冻存牛精液中0.02 TCID50的病毒粒子,检测时间在3 h之内,是OIE已报道方法灵敏度的40~400倍,是病毒分离方法灵敏度的100倍。120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液中,检测到阳性样品25份,用普通PCR检测得到阳性样品15份,病毒分离检测得到阳性样品12份。检测结果表明,精液为阳性的牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性的牛精液中也不一定携带病毒。【结论】建立了牛精液中IBRV的荧光PCR检测方法;通过分析精液带毒与血清抗体的关系,进一步表明不能简单地以血清抗体阴阳性作为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒具有间歇性。     

河南省规模化猪场支气管败血波氏杆菌的流行病学研究

为了解河南省规模化猪场支气管败血波氏杆菌的流行病学情况,2015—2017年应用染色镜检、生化试验和PCR检测等方法进行支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)的分离与鉴定,从全省规模化猪场有明显萎缩性鼻炎症状猪的1 022份样品中,共分离鉴定到82株Bb,总分离率为8.0%。其中,有30份组织病料只分离出波氏杆菌,52份共感染病料以S.suis,HPS,E.coli,Pm居多,且鼻拭子分离率低于肺脏组织。说明Bb在河南省猪群的感染十分普遍,且与其他细菌协同感染情况非常普遍,在猪萎缩性鼻炎的发生中具有重要作用。     

兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌复合PCR方法的建立及临床应用

根据Gen Bank中多杀性巴氏杆菌ATP合成酶基因(atp B)的保守序列设计特异性引物,建立巴氏杆菌PCR检测方法,并与已建立的支气管败血波氏杆菌PCR检测方法进行合并,经反应条件的优化,成功建立多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌复合PCR诊断方法。该方法检出的最小多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌菌数分别为40 CFU和4 CFU;对兔源产气荚膜梭菌、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪鼻支原体、链球菌的检测结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。用该方法对中国4个省份采集的临床鼻拭子样本共712份进行检测,结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为25.56%,支气管败血波氏杆菌阳性率为34.55%,双阳性率为13.20%。该复合PCR方法能快速、敏感地从家兔鼻拭子样品中检出多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌,为临床疾病检测和流行病学调查提供了技术保障。     

LAMP技术诊断猪支原体肺炎的应用研究

应用环介导等温扩增技术(LAMP)对猪支原体肺炎进行诊断应用研究,对来自黑龙江不同地区的患猪呼吸道疾病的肺脏病料64份进行检测,54份诊断为阳性,阳性率84.3%。健康猪鼻拭子共176份,经LAMP检测,157份为阳性,阳性率为89.2%。其中健康猪拭子带菌率较高,结果表明,LAMP技术可应用于猪支原体肺炎的临床诊断。     

新疆牛羊产业链中金黄色葡萄球菌的污染调查与毒力基因检测

【目的】 分析乌鲁木齐及周边地区牛羊源金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的污染状况及常见毒力基因检测。【方法】 采集乌鲁木齐及周边地区牛养殖场和牛羊屠宰场752份样品(粪样、挤奶厅工具拭子、胴体拭子、屠宰工具拭子等),采用国家标准方法进行金黄色葡萄球菌分离和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的鉴定,检测10种常见毒力基因(sea、seb、sec、fnbA、fnbB、hla、hlb、clfa、pvl、tst)的编码情况。【结果】 共分离出26株金黄色葡萄球菌,分离率为3.46%,其中奶牛养殖场、牛屠宰场和羊屠宰场的分离率分别是4.39%、1.13%、3.72%、。其中有8株是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,占检出率的30.77%。毒力基因sea、seb、sec、fnbA、fnbB、hla、hlb、clfa、pvl、tst的检测率分别是11.54%、19.23%、3.85%、3.85%、23.08%、100%、53.85%、100%、0、15.38%,其中clfa和hla的检出率最高。 【结论】 新疆奶牛养殖场和牛羊屠宰场中均存在金黄色葡萄球菌,其中奶牛养殖场中MRSA的污染较严重,金黄色葡萄球菌主要编码hla和clfa 2种毒力基因。     

湖北地区禽源性空肠弯曲菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解湖北省禽源空肠弯曲菌的流行病学及耐药性情况,从武汉市及其周边地区采取禽源样品276份,其中肛拭子175份,盲肠内容物101份。共分离出50株空肠弯曲菌,分离率为18.12%,其中肛拭子分离20株,盲肠内容物分离30株。结果显示,不同采样途径空肠弯曲菌的分离率不同,盲肠内容物分离率高于肛拭子。采用定性测定纸片扩散法对以上分离的菌株进行药敏试验,50株空肠弯曲菌分离株对氨基糖苷类药物敏感性最高(S≥66.0%),其次分别是红霉素(S=70.0%)和磺胺甲基异恶唑(S=58.0%)。对喹诺酮类药物耐药性最强(R=100%)。     

新疆部分地区牛源空肠弯曲菌分离鉴定及耐药性分析

【目的】研究新疆部分地区牛空肠弯曲菌污染及耐药性。【方法】从乌鲁木齐、昌吉、石河子3个地区共采集牛肛拭子171份。用布氏肉汤初步增菌后,用改良CCD琼脂基础和哥伦比亚血平板2种选择培养基培养,用聚合酶链式反应(PCR)鉴定,最后参照2010年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐使用的琼脂扩散法进行药敏试验。【结果】从乌鲁木齐牛场肛拭子分离鉴定到1株空肠弯曲菌(编号为N22),检出率为1.11%(1/90);昌吉牛场肛拭子分离鉴定到1株空肠弯曲菌(编号为C25),检出率为3.33%(1/30)。石河子牛场肛拭子没有分离到空肠弯曲菌。2株空肠弯曲菌对单环β内酰胺类、氨基糖苷类抗生素高度敏感;对喹诺酮类抗菌药物、大环内酯类和大部分头孢菌素类抗生素产生了不同程度的耐药。【结论】新疆牛群存在空肠弯曲菌的感染,感染菌株可用单环β-内酰胺类、氨基糖苷类抗生素进行防治。研究结果可为评价新疆牛群空肠弯曲菌的流行状况和制定防控措施提供科学依据。     

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。     

牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定及gD基因序列分析

[目的]从疑似牛传染性鼻气管炎病毒感染的牛鼻腔棉拭子中分离出1株病毒,对其进行鉴定和序列分析。[方法]从疑似牛传染性鼻气管炎病毒感染的牛鼻腔棉拭子中分离到1株病毒,将其命名为NM株。通过PCR、MDBK细胞病变观察、中和试验、动物回归试验、gD基因序列分析对其进行鉴定。[结果]确定该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒强毒株。NM株病毒能使MDBK细胞产生牛传染性鼻气管炎病毒典型性细胞病变。Reed-Muench法测定NM株病毒的TCID50为10-6.0/ml。NM株病毒与IBRV阳性血清发生中和反应,而与IBRV阴性血清不发生中和反应。NM株病毒能使8月龄IBRV抗体阴性牛致病,表现出牛传染性鼻气管炎的典型临床症状。gD基因序列鉴定结果表明NM株病毒与IBRV K22株的同源性最高。[结论]该研究可为IBR诊断试剂与疫苗的研制奠定基础。