紫外诱导下麦长管蚜细胞色素b基因和SOD基因的克隆与序列分析

【目的】证实前期消减文库的研究结果,揭示紫外诱导条件下麦长管蚜的生态遗传机理。【方法】根据前人研究证明的细胞色素b基因和SOD基因的保守性区域,设计特异性引物,采用RT-PCR方法,扩增紫外线照射24,48h和对照麦长管蚜变异基因的部分序列,进行测序及核苷酸分析,并推导氨基酸序列。【结果】RT-PCR扩增分别得到长度420bp的细胞色素b基因cDNA片段和357bp的超氧化物歧化酶(SOD)基因cDNA片段。序列分析表明,细胞色素b基因编码140个氨基酸残基,30W紫外辐射48h处理的麦长管蚜细胞色素b基因突变位点为3个,其编码的氨基酸序列变异位点为2个;SOD基因编码119个氨基酸残基,且对照与处理的序列一致,未发现变异位点。【结论】紫外诱导条件下,麦长管蚜细胞色素b基因发生突变部分的具体位点已经找到,其突变方式为转换和颠换;SOD基因未发现变异位点。     

烟实夜蛾细胞色素P 450 cDNA片段的克隆与序列分析

昆虫细胞色素P 450与昆虫抗药性关系密切,本研究以烟实夜蛾5龄幼虫中肠的总RNA为模板,设计并合成简并引物,利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出了烟实夜蛾细胞色素P 450基因的cDNA片段,将其克隆到pMD 18-T载体进行序列测定,测序得到的491 bp的片断编码163个氨基酸残基,且该片断在阅读框内.与已公布的谷实夜蛾、棉铃虫和烟芽夜蛾细胞色素P 450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为98.7%,98.7%和92.1%.     

烟实夜蛾细胞色素P 450 cDNA片段的克隆序列分析

昆虫细胞色素P 450与昆虫抗药性关系密切,本研究以烟实夜蛾5龄幼虫中肠的总RNA为模板,设计并合成简并引物,利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出了烟实夜蛾细胞色素P 450基因的cDNA片段,将其克隆到pMD 18-T载体进行序列测定,测序得到的491 bp的片断编码163个氨基酸残基,且该片断在阅读框内.与已公布的谷实夜蛾、棉铃虫和烟芽夜蛾细胞色素P 450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为98.7%,98.7%和92.1%.     

杨树形成层区域扩张蛋白PtEXP1基因的克隆与分析

以矮牵牛的cDNA核苷酸序列为基础,利用杨树EST数据库和毛果杨基因组测序结果,通过序列的拼接设计合成了基因特异引物,从毛白杨形成层cDNA中扩增出一个长为1 009 bp的cDNA片段,将该片段连接到pGEM-T载体中并测序。测序结果表明,该片段含有完整的开放阅读框,共编码258个氨基酸残基。蛋白序列系统进化分析结果表明,该基因属于exp ansin基因家族-αexp ansin中的A亚家族,编码的氨基酸序列与芒果、欧洲山杨×美洲山杨杂交种、拟南芥和矮牵牛的-αexp ansin基因编码的氨基酸序列同源性分别为91%,88%,86%和86%。     

球毛壳菌二烯醇内酯水解酶基因克隆及序列分析

以球毛壳茵cDNA文库中获得的二烯醇内酯水解酶基因片段(GenBank Accn：BP099060)为基础,用RACE技术克隆出该基因的全长cDNA序列。序列长919bp,由450bp的3’RACE产物和608bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框762bp,编码253个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为27．5kD,理论等电点为5．98。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成,外显子与内含子剪连接区符合AG—GT规则。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY465528,AY555772,AAS66899)。     

两个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的克隆与分析

为了深入研究入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)对农药等外源物的作用机制,采用RACE的方法克隆了2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的开放阅读框序列.其中一个基因的开放阅读框包含1 536 bp的片段,编码512个氨基酸,其相对分子质量为59 843.5,理论等电点为8.79,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;其具有WXXXR(WKNLR)、EXXR(ETLR)序列及FXXGXXXCXG/A(FGEGPRICIG)血红色素结合位点等细胞色素P450特有的氨基酸序列,其中ETLR属于CYP6家族所特有,且其blast比对均与昆虫体内CYP6A家族的相似性较高,将其命名为PsCYP6a1.另一个基因的开放阅读框包含1 575 bp的片段,编码525个氨基酸,相对分子质量为61 246.62,理论等电点为8.87,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;与前者相似,也包含了相应的细胞色素P450基因的保守位点,将其命名为PsCYP6a2.2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的核苷酸序列的相似性为55.56%,氨基酸序列的相似性为39.41%,相似的残基占了44.12%.     

扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的克隆及序列分析

[目的]从扩展莫尼茨绦虫中克隆β微管蛋白基因,进行序列测定和生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——β微管蛋白基因,全长1571 bp,编码444个氨基酸,与日本血吸虫的β微管蛋白氨基酸序列具有78.6;的同源性.编码蛋白的理论分子量为49.6 ku,等电点为4.96;1 -4位氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140～146位GGGTGAG存在一个微管蛋白标志信号片段,在99～106位和391～410位存在两个典型的β微管蛋白保守区;亚细胞定位分析其为细胞的骨架蛋白.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的全长cDNA序列,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础.     

2种泥鳅生长激素基因cDNA的克隆和原核表达研究

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了泥鳅和大鳞副泥鳅的生长激素(GH)基因cDNA,分析了其核苷酸序列和推测的氨基酸序列.结果表明:2种泥鳅生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.在cDNA序列上2者有11个核苷酸的差异;在蛋白质水平上,2者的差异仅为1个氨基酸,位于信号肽中,在成熟多肽中,2者的氨基酸序列相同.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体.细菌裂解液沉淀溶于浓度为8mol/L的尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量为24 kDa的单一蛋白带.     

小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

用TRIZOL法提取了小卷蛾斯氏线虫RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)技术克隆了两条小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因cDNA的3′端序列。将得到的cDNA序列提交到GenBank,分别获取登录号EU049857和EU049858。两个序列长度分别为1372碱基(SCTUB1)和1374碱基(SCTUB2),分别编码434和432个氨基酸,编码的蛋白的分子量在48kDa左右。氨基酸的124~131位存在一个微管蛋白信号片段GGGTGSG。序列分析表明,分离得到的两个基因与其他线虫的微管蛋白基因具有较高的同源性,核苷酸序列同源性在65%以上,氨基酸序列同源性在81%以上,两个氨基酸序列都含有两个氨基酸保守区NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE。     

木薯氰化物合成限速酶CYP79D2基因克隆与序列分析

 亚麻苦苷和百脉根甙等氰化物是木薯块茎、茎叶等组织或器官中的剧毒物质,细胞色素p450是调控氰化物生物合成的关键酶基因,克隆有关酶基因对于理解木薯氰化物代谢和通过转基因对木薯氰化物的改良具有重要意义。根据国际数据库中的木薯氰化物合成限速酶基因序列信息,设计特异引物,通过同源克隆法,从木薯中克隆出1626bp cDNA基因序列。序列分析表明,克隆基因共编码541个氨基酸,与数据库中的木薯CYP79D2基因在核苷酸序列、氨基酸序列同源性上均达到99％,并含有相应基因家族的保守区域,确定克隆到木薯CYP79D2全长基因。     

鮸鱼应激蛋白STI1基因克隆及表达分析

根据获得的鮸鱼应激蛋白(stress-inducible protein I,STI1)基因的EST序列,克隆测序获得鮸鱼STI1基因的全长cDNA序列。鮸鱼STI1基因全长为2 194bp,包括5’非翻译区31bp,3’非翻译区634bp,开放阅读框1 629bp,编码542个氨基酸。根据氨基酸序列推测鮸鱼STI1分子中含有5个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个多聚脯氨酸识别位点,2个核定位信号识别位点,9个TPR结构域。对物种间STI1基因比对表明,鮸鱼存在保守的半胱氨酸位点,与其他物种STI1基因的相似性在76.5%～94.3%之间。用邻接法构建的STI1基因的系统发育树表明,硬骨鱼类的STI1基因形成独立的一支,其中鮸鱼与大黄鱼的STI1基因同源性最高。荧光定量PCR结果显示,鮸鱼STI1基因的mRNA主要分布于肌肉和肾脏中。     

F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化

类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3’,5-’hydroxylase;F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素。从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段。F3′5′H的cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34%,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸。将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6%。将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上,并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株。     

中华蜜蜂AccMRJP1基因克隆及在大肠杆菌中的表达

根据中华蜜蜂Acc MRJP1表达序列标签(EST)序列,从已完成EST测序的蜂脑cDNA文库中选出3个Acc MRJP1克隆,通过PCR检测和测序筛选获得1个cDNA全长为1 302 bp、可编码433个氨基酸残基的Acc MRJP1开放阅读框(ORF),该氨基酸序列与已报道的Acc MRJP1编码序列(AY279539)的同源性为99.8%.将该Acc MRJP1基因克隆到表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21中进行融合表达.SDS-PAGE电泳分析显示一条分子量大小约76 ku、占细胞总蛋白17.7%的特异性条带;以谷胱甘肽转移酶(GST)多克隆抗体为一抗作Western blot分析,检测到Acc MRJP1与GST的融合表达蛋白印迹,并通过亲和柱分离获得了纯化的表达产物,证明Acc MRJP1基因已表达成功,这为开展MRJP1的生物工程利用提供了技术基础.     

RACE方法获得番茄蓝光受体基因Phototropin-2全长及其过量表达载体的构建

采用RACE及降落PCR技术从番茄幼苗总RNA中克隆出PHOT-2基因的3’及5’末端片断,并根据测序结果,设计拉基因全长引物获得了PHOT-2基因全长。结果表明,该基因全长3 381 bp,含开放阅读框2 856 bp,编码952个氨基酸;与拟南芥PHOT-2氨基酸序列相比,同源性高达68%,主要功能区域同源性高达99%。将番茄PHOT-2基因定向插入pHB质粒中构建成过量表达载体,重组质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞。     

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因“F3′5′H”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F3′5′H”在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98．55％。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与“F3′5′H”构建成能够在植物中进行道传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。     

猕猴桃钙调蛋白cDNA的克隆及测序

以“秦美”猕猴桃果实呼吸跃变初期ｃＤＮＡ第一链为模板，参考大麦钙调蛋白基因序列合成５′端和３′端引物，利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）合成了完整的猕猴桃钙调蛋白ｃＤＮＡ，克隆并测定了其全序列。结果表明，猕猴桃钙调蛋白基因读码框架内序列由４４４个核苷酸组成，共编码１４８个氨基酸，且与植物领域里发表的大麦及苜蓿的钙调蛋白基因有很高的同源性。在核苷酸序列上与大麦有８６．１６％的同源性，与苜蓿有８５．６９％的同源性，其编码的氨基酸与大麦和苜蓿的不同分别只是一个氨基酸的差异，同源率高达９９．３％．     

矮牵牛花色CHS-A基因启动子(Pchsa)的克隆及序列分析

根据国外报道,矮牵牛花色相关基因CHS-A的启动子Pchsa具有花期特异性启动子的活性,人工合成2个特异性引物并从矮牵牛基因组中经PCR分离出长约500 bp的DNA片段,经纯化后测序得到499 bp的目的片段。在NCBI中通过BLAST程序与序列号为S52984的PchsA比较,其同源性为95.73%。应用DNAMAN软件进行序列分析,结果表明该片段除含有启动子的保守序列TATA-box、CAAT-box、GC-box、G-box外,还含有花期特异表达的启动序列TACPyAT-box。这为该序列在花卉改良中的进一步运用奠定了基础,同时也证明不同品种间的PchsA存在差异。     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。