脱落酸对棉花体细胞胚胎发生的影响

【目的】研究脱落酸(Abscisic acid, ABA)对棉花体细胞胚胎发生过程中下胚轴脱分化和再分化的影响,优化体细胞胚胎发生体系和初步解析脱落酸调控棉花体细胞胚胎发生分子机制。【方法】以棉花品种中棉所24(CCRI 24)下胚轴为外植体,设置5个ABA浓度0、0.02、0.04、0.06、0.08μmol·L^-1,分别以A0、A1、A2、A3、A4表示,添加至MSB(MS培养基+B5维生素)培养基诱导愈伤和胚性愈伤,研究ABA对棉花下胚轴初始细胞脱分化、愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导的影响。【结果】ABA促进下胚轴初始细胞脱分化;显著提高愈伤组织的脱分化率和增殖率;0.02μmol·L^-1ABA显著提高胚性愈伤分化率,0.04~0.08μmol·L^-1ABA显著降低胚性愈伤分化率。ABA处理后胚性愈伤和非胚性愈伤的增殖率均显著提高且质地受到影响。0.02~0.08μmol ABA处理下,LBD和LBD在愈伤起始期上调表达。0.02μmol·L^-1ABA处理下,在愈伤增殖早期和中期BBM、LEC1和AGL15上调表达,愈伤增殖后期FUS3、LEA、ABI3基因上调表达。【结论】脱落酸调控的棉花体细胞胚胎发生与相关标记基因的时空性表达密切相关,这些基因表达水平的增加是ABA调控愈伤和胚性愈伤分化的分子基础。     

脱落酸对棉花体细胞胚胎发生的影响

【目的】研究脱落酸(Abscisic acid, ABA)对棉花体细胞胚胎发生过程中下胚轴脱分化和再分化的影响,优化体细胞胚胎发生体系和初步解析脱落酸调控棉花体细胞胚胎发生分子机制。【方法】以棉花品种中棉所24(CCRI 24)下胚轴为外植体,设置5个ABA浓度0、0.02、0.04、0.06、0.08μmol·L~(-1),分别以A0、A1、A2、A3、A4表示,添加至MSB(MS培养基+B5维生素)培养基诱导愈伤和胚性愈伤,研究ABA对棉花下胚轴初始细胞脱分化、愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导的影响。【结果】ABA促进下胚轴初始细胞脱分化;显著提高愈伤组织的脱分化率和增殖率;0.02μmol·L~(-1)ABA显著提高胚性愈伤分化率,0.04～0.08μmol·L~(-1)ABA显著降低胚性愈伤分化率。ABA处理后胚性愈伤和非胚性愈伤的增殖率均显著提高且质地受到影响。0.02～0.08μmol ABA处理下,LBD和LBD在愈伤起始期上调表达。0.02μmol·L~(-1)ABA处理下,在愈伤增殖早期和中期BBM、LEC1和AGL15上调表达,愈伤增殖后期FUS3、LEA、ABI3基因上调表达。【结论】脱落酸调控的棉花体细胞胚胎发生与相关标记基因的时空性表达密切相关,这些基因表达水平的增加是ABA调控愈伤和胚性愈伤分化的分子基础。     

棉花组织培养直接胚胎发生和植株再生

选用陆地棉(GossypiumhirsutumL.)品种中棉所12,首次直接诱导获得棉花体细胞胚胎发生,并获得了再生植株。结果表明,激素是影响棉花体细胞胚胎直接发生的重要因素,单独使用ZT可直接诱导获得棉花胚性愈伤组织和胚状体,2,4-D的添加虽有利于愈伤组织的形成,但却没能直接诱导获得胚性愈伤组织,IAA的添加削弱了ZT的诱导效果。下胚轴、子叶和胚根直接诱导获得胚胎发生的能力不同,其中以子叶的分化能力最强,胚根次之,下胚轴较差。实验中,棉花体细胞胚胎直接发生的最高频率为11.42%,占诱导获得总愈伤组织的44.44%。     

低酚陆地棉直接体细胞胚胎发生和植株再生

选用低酚陆地棉无菌苗下胚轴为材料进行全固体组织培养,直接诱导获得了胚性愈伤组织,并进一步分化为再生植株.结果表明,激素是影响棉花直接体细胞胚胎发生的重要因素.MSB培养基中添加2,4-D有利于愈伤组织的形成,却不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基中添加IBA和BA也不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基附加适当浓度的IBA和KT能直接诱导出胚性愈伤组织.最适激素组合(1.0 mg/L IBA,0.5 mg/L KT)能使诱导棉花下胚轴产生大量胚性愈伤组织,并且在3个月内就可肉眼观察到不同发育时期的胚.MSB培养基中附加1.0 g/L谷氨酰胺和0.5 g/L天门冬酰胺有利于胚萌发成苗.本研究建立了简便高效的棉花直接体细胞胚胎发生和植株再生培养体系,从胚性愈伤组织诱导到植株再生约需5～6个月时间.     

两种常用激素组合下棉花体细胞胚胎发生过程的组织学观察

 MSB培养基添加两种常用植物激素组合，Indole-3-butyric acid (IBA) + kinetin (KT)和2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) + KT，分别命名为IK和DK处理用来诱导陆地棉体细胞胚胎发生。陆地棉品系YZ1下胚轴切段作为外植体在诱导培养基上培养4周后，继代到分化培养基上促进体细胞胚胎发生。结果表明，两种处理均有体细胞胚胎发生，其中IK处理上外植体嫁接33 d后就可见体细胞胚出现，分化率高达97.6%，大多数外植体表现为体细胞胚较胚性愈伤早出现。DK处理中体细胞胚胎发生慢，体细胞胚都是经过明显的胚性愈伤发育而来，胚性愈伤分化率明显低于IK处理，仅为28.6%。此外，IK处理中的外植体在培养过程中大部分都出现了须根，而DK处理中则没有。两种处理中出现了两种不同的体细胞胚胎发生过程，组织学观察结果表明DK和IK处理中的体细胞胚分别主要起源于初生形成层和皮层。     

海岛棉愈伤组织诱导及分化的影响因素初探

本研究以新疆自育海岛棉品种新海16无菌苗下胚轴为外植体材料,进行愈伤组织诱导、分化及再生植株的初步研究,筛选出适合于海岛棉体细胞胚胎再生的培养体系。结果表明,最佳诱导愈伤组织及分化配方为MSB附加0.1mg/L2,4-D及0.05mg/LKT,分化率达到88%;于MSB1附加0.01mg/LKT及0.3mg/LNAA中对胚性愈伤组织进行增值培养;由MSB2附加0.1mg/LIBA中可分化出成熟体细胞胚胎及再生植株,分化率达73%。本研究通过体细胞胚胎发生途径获得了海岛棉再生植株,为海岛棉遗传转化体系的建立及分子育种奠定了基础。     

卡那霉素对棉花下胚轴愈伤组织生长的影响

以三个具有不同特点的棉花新品系为试材的研究表明，卡那霉素对棉花下胚轴的愈伤组织形成和增殖均有明显的抑制作用，随其浓度的增加，愈伤组织形成的频率降低，增殖的倍数减少；当浓度增加到１００ｍｇ·Ｌ－１时，愈伤组织严重褐化，其正常生长受到完全抑制；下胚轴形态学上端切段较下端切段更易受卡那霉素的影响     

棉花愈伤组织分化过程中的DNA甲基化分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的途径之一,在维持生物基因组稳定性与调控基因转录和表达中起着重要作用。为明确棉花愈伤组织分化过程中基因组DNA的甲基化变异模式以及甲基化图谱,本研究利用全基因组亚硫酸盐测序(WGBS)技术对棉花愈伤组织分化(非胚性与胚性)过程中的DNA甲基化模式进行了全面比较。全基因组DNA甲基化分析表明,在棉花愈伤组织分化过程中非胚性愈伤组织的mCG与m CHG所占比率高于胚性愈伤组织,而不对称m CHH的比率则低于胚性愈伤组织;非胚性愈伤组织的mCG、m CHG、mCHH及mC的平均甲基化水平均低于胚性愈伤组织。基因组甲基化区域分析表明,棉花愈伤组织分化过程中基因间、启动子和基因下游(转录终止位点下游2 kb)的甲基化水平较高,同时胚性愈伤组织的基因间、启动子及基因下游的平均甲基化水平均高于非胚性愈伤组织。因此,本研究分析了棉花愈伤组织全基因组DNA甲基化水平,为进一步研究棉花体细胞胚胎发生的表观遗传机制提供了依据。     

关键因子对棉花利用农杆菌介导法导入外源基因的影响

用5～6d的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培,将Bt基因和tfdA基因导入棉花。菌株质粒中GUS基因为标记基因,NPTⅡ基因为选择基因。在含有0.1mg/L2,4-D和0.1mg/LKT的MS培养基上共培48h,转移到添加头孢霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织。70～80d时,进行GUS检测,选择GUS阳性愈伤组织,经体细胞胚     

长江和黄河流域棉区棉花品种体细胞胚胎发生和植株再生比较研究

选用我国长江和黄河流域棉区各10个棉花品种以及珂字201和YZ1共22个基因型,研究和优化棉花体细胞胚胎发生的相关条件参数。在此基础上,比较了两生态区棉花品种的体细胞再生能力。结果表明, 在IBA+KT的激素组合下,多数基因型有较强再生能力;在愈伤组织诱导时期,铵态氮是必需的,而在愈伤组织继代分化时期,一定浓度的硝态氮则能促进分化;没有铁盐不能诱导出愈伤组织,而铁盐浓度为56 mg L^-1时有利于胚分化;长江流域和黄河流域棉花品种的植株再生潜力没有明显差别,但长江流域的品种体细胞胚胎发生所需的时间长。本文首次获得了鄂抗棉3号、5号、鄂棉20、鄂棉23、豫棉9号、豫早73、豫棉12、豫棉1221等8个品种的体细胞胚胎发生和植株再生。     

不同农杆菌菌株和棉花品种在转基因棉花中的应用研究

本试验采用农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＡＧＬ—１—１１、４４０４—７、２０８—１、２８１—６，与陆地棉品种晋棉７号、柯字２０１、相字３１２、冀合３２１的下胚轴切段共同培养，将Ｂｔ内毒素基因导入棉花愈伤组织，经体细胞胚胎发生途径转化再生植株。试验结果表明：菌株间转化率差异较大，菌株ＡＧＬ—１—１１、４４０４—７表现较好。品种之间在转化率上互有高低，差异不显著     

陆地棉体细胞胚胎发生过程中的细胞外基质研究

 研究棉花体细胞胚胎发生对于促进棉花基因工程育种具有重要意义。利用扫描电镜和透射电镜对陆地棉体细胞胚胎发生过程的研究发现,细胞外基质在棉花体细胞胚胎发生的不同阶段呈现出有规律的动态变化。当普通愈伤组织细胞发育成胚性愈伤组织时,细胞外基质就会出现;随着原胚的形成,细胞外基质就会形成发达的网络状结构;随着胚状体的进一步形成和发育,细胞外基质则逐渐降解。在愈伤组织和非胚性愈伤组织中,始终未发现细胞外基质。结果表明,细胞外基质与体细胞胚胎发生能力关系密切,是原胚形成的重要标记。     

卡那霉素对棉花胚性愈伤组织生长发育的影响

卡那霉素对棉花胚性愈伤组织的增殖、胚胎发生及发育均有一定的抑制作用,但不同浓度的卡那霉素对棉花胚性愈伤组织的生长发育作用程度不同,低浓度较弱,高浓度较强;胚性愈伤与体细胞胚生长发育的不同阶段对卡那霉素的敏感性有所不同。在棉花遗传转化过程中,卡那霉素浓度不能低于５０ｍｇ·Ｌ－１,胚性愈伤的继代培养时间应控制在３０ｄ左右。     

棉花遗传转化和植株再生的研究

利用农杆菌（ＧＵＳ基因（β－葡萄糖苷酸酶基因）为标记基因，ＮＰＴⅡ为选择基因）用共培法对棉花下胚轴切段直接转化，在０．１ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ和０．１ｍｇ／ＬＫＴ的ＭＳ的培养基上共培４８ｈ，转移到加头孢霉素５００ｍｇ／Ｌ和５０～１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素的上述培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织，７０～８０天计算愈伤组织的诱导频率，并有组织化学定位法检测ＧＵＳ基因的表达，统计转化频率，结果表明：平均出愈率为４０     

植物体细胞胚胎发生机理的研究进展

 体细胞胚胎的诱导是大多数植物组织培养中的关键环节。在愈伤组织分化胚性愈伤组织的过程中,随着细胞功能的转变,细胞内部基因的差异表达,引起了植物体内蛋白质组分、酶组分与活性、激素等各方面的变化,这些变化一直是组织培养研究中的热点。本文对体细胞胚胎的氨基酸变化、标记性蛋白、基因的差异表达、同工酶变化、激素动态和高体细胞胚胎发生率的材料遗传与选育等方面的研究进展作了综述。     

陆地棉体细胞胚胎发生过程中的mRNA差异显示分析

以未经诱导的棉花下胚轴、经愈伤诱导10d的下胚轴和胚性愈伤组织为材料,利用差异显示反转录 PCR(DDRT PCR)技术对陆地棉体细胞胚胎发生过程中的cDNA差异表达进行了初步研究。反转录获得cDNA第一链,经3个锚定引物和随机引物的DDRT PCR,产物经测序胶电泳分离,共得到约200个差异表达cDNA片段,其中51个为陆地棉胚性愈伤组织所特有,从中还获得相关基因上游或下游的调控系列,从其中一个样品中可成功分离、克隆24个cDNA片段。经Northern杂交验证,从获得的差异片段中找到了一个能稳定出现的阳性cDNA片段,该片段仅出现在胚性愈伤组织阶段。对该片段进行克隆、测序和序列同源性分析,发现该片段是一个功能未知的cDNA片段。     

茶树愈伤组织继代培养与体细胞胚发生

利用添加不同种类,浓度的１／２ＭＳ修改培养基、Ｂ５培养基交叉培养茶树（ＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓＬ．）愈伤组织,有利于延长愈伤组织继代培养时间,并维持胚性愈伤组织高的体细胞胚分化能力,不同品种的胚性愈伤组织体细胞胚分化率存在明显差异,试管苗茎胚性愈伤组织分化率高于大田栽培的成龄茶树叶柄胚性愈伤组织。胚性愈伤组织随着继代培养时间的延长,体细胞胚分化率随之有所下降,胚性愈伤组织在继代培养过程中,     

棉花优良品种中棉所19高频体细胞胚胎发生细胞系筛选与植株再生

选用我国优良棉花品种中棉所19进行组织培养, 研究了该品种的体细胞胚胎发生和植株再生能力。 中棉所19的体细胞胚胎发生有两种情况： 一是由外植体直接诱导获得胚性愈伤组织和体细胞胚; 二是先诱导获得愈伤组织, 再经继代培养获得胚胎发生。 单独使用ZT可在早期诱导胚胎发生, 在该情况下, 对子叶的诱导能力最强, 胚根     

绿色棉新彩棉7号体细胞胚胎发生及其植株再生

以绿色棉新彩棉7号的子叶、下胚轴为外植体,MSB(MS培养基附加B5维生素)基本培养基附加不同激素组合,诱导愈伤组织及调控分化,通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株.结果表明:0.1 mg· L-1 KT(Kinetin,激动素)+ 0.1 mg·L-12,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic,2,4-二氯苯氧乙酸)为诱导愈伤组织的最适植物激素组合,不同外植体处理出愈率均达到100％,但下胚轴纵切面背向培养基放置培养更有利于诱导愈伤组织形成;分化调控阶段的最佳植物激素组合为0.15 mg·L-1 KT+ 0.3 mg·L-1 IBA(Indole-3-butyric acid,吲哚丁酸),胚性愈伤分化率可达23.33％; MSB中去除NH4NO3同时KNO3加倍,附加0.5 g·L-1Asn(Asparagine,天冬酰胺)和lg· L-1 Gln(Glutamine,谷氨酰胺),胚性愈伤可进一步分化获得体细胞胚,将成熟的子叶胚接种于1/2MS获得完整的再生植株. 本研究通过体细胞胚发生途径获得了新彩棉7号的再生植株,为天然彩色棉基因工程研究奠定了一定基础.     

羧苄西林钠对棉花愈伤组织诱导和生长的影响

取陆地棉珂字 2 0 1七日龄无菌苗的子叶和下胚轴 ,分别切割成 0 .5cm见方的切块以及 0 .5cm左右长的切段 ,接种于附加羧苄西林钠浓度分别为 0 ,1 0 ,2 0 ,40 ,60 ,80 ,1 0 0 ,1 2 0 mg.L- 1的改良MS培养基上培养 ,以观察羧苄西林钠对棉花不同外植体脱分化形成愈伤组织的影响。取在不含羧苄西林钠培养基上下胚轴诱导产生的愈伤组织转入同一培养基上增殖 ,2 0 d后挑选生长均匀、发育良好的愈伤组织接种于附加羧苄西林钠浓度分别为 0 ,1 0 ,2 5,50 ,75,1 0 0 ,1 50 mg.L- 1的培养基上培养 ,以观察羧苄西林钠对棉花愈伤组织增殖的抑制作用。在…